肝靶向荧光探针用于HepG2细胞中ONOO-的特异性检测

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220268

摘要/Abstract

摘要：

过氧亚硝酸根（ONOO^-）作为重要的生物活性分子，在细胞信号转导和稳态调节等过程中发挥着重要的作用。实现生物体ONOO^-的精准靶向检测，对于深入探索其生理病理机制至关重要。本文以1，8-萘二甲酰亚胺作为荧光发色团、熊去氧胆酸作为肝靶向单元，制备荧光探针N-丙基-4-（4-3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酰肼基）-1，8-萘二甲酰胺（NA），用于人肝癌细胞（HepG2）中ONOO^-的特异性检测。该探针与ONOO^-响应后，其绿色荧光显著增强，且荧光强度与ONOO^-浓度在0~14.0 μmol/L范围内呈现较好的线性关系，检测限为0.27 μmol/L。该探针具有选择性强、受pH环境影响小和生物相容性好等优点。细胞荧光成像结果表明，该探针对肝癌细胞HepG2具有较好的靶向性，可以对HepG2细胞中外源性和内源性ONOO^-浓度进行特异性检测。

关键词: 过氧亚硝酸根, 肝靶向, 荧光探针, 荧光成像

Abstract:

As an important biologically active molecule， peroxynitrite （ONOO^-） plays an important role in cellular signal transduction and homeostatic regulation. Precise and targeted detection of ONOO^- in biological systems is crucial for in-depth exploration of its physiological and pathological mechanisms. A “turn-on” fluorescent probe naphthalamide derivative （NA） is designed based on 1，?8-naphthalene imide and ursodeoxycholic acid for specific detection of ONOO^- in HepG2 cells. Probe NA is synthesized by three steps， the structures of intermediates and target compounds are confirmed by ¹H NMR and ¹³C NMR spectroscopy and HRMS. The optical properties of probe NA are explored. The green fluorescence of probe NA in the presence of ONOO^- is significantly increased compared to its fluorescence in the absence of ONOO^-. The fluorescence intensity and concentrations of ONOO^- shows a good linear relationship in the range of 0.0 to 14.0 μmol/L， with the detection limit of 0.27 μmol/L. In addition， probe NA shows excellent selectivity toward ONOO^-， good biocompatibility， and the fluorescence intensity is almost independent to the pH of the environment. Finally， probe NA is applied to monitor ONOO^- in living cells. The results of cell fluorescence imaging exhibit that probe NA possesses good targeting ability to HepG2 cells， and can detect exogenous and endogenous ONOO^- in HepG2 cells， which demonstrates the great potential of in the application of ONOO^- detection in vivo.

Key words: Peroxynitrite, Liver targeting, Fluorescent probes, Fluorescence imaging

中图分类号:

O625

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图/表 8

图1 探针NA的合成路线

Fig.1 Synthetic route of probe NA

图2 探针NA （10 μmol/L）与ONOO-（100 μmol/L）响应前（a）、后（b）的荧光发射光谱

Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe NA （10 μmol/L） before （a） and after （b） responding to ONOO-（100 μmol/L）

图3 （A）探针NA（10 μmol/L）与不同浓度ONOO-反应后荧光发射光谱（λex=451 nm）；（B）探针NA荧光强度与ONOO- 浓度的线性关系

Fig.3 （A） Fluorescence emission spectra of probe NA （10 μmol/L） reacting with different concentrations of ONOO-（λex=451 nm）；（B） Linearity curve between the fluorescence intensity of probe NA and the concentration of ONOO-

图4 探针NA（10 μmol/L）与不同活性物质混合后荧光强度（λex=451 nm）

Fig.4 Fluorescence intensity of probe NA（10 μmol/L） mixing with different reactive substances （λex=451 nm）

图5 pH对探针NA（10 μmol/L）响应ONOO-前（a）、后（b）的影响（λex=451 nm）

Fig.5 Effect of pH on probe NA （10 μmol/L） before （a） and after （b） responding to ONOO- （100 μmol/L）（λex=451 nm）

图6 不同浓度探针NA对HepG2细胞存活率的影响

Fig.6 The viability of HepG2 cells incubated with different concentration of probe NA

图7 探针NA（30 μmol/L）分别在（A） A549细胞、（B） HCT116细胞和（C）HepG2细胞中孵育30 min后的荧光成像；D-F分别为A-C的明场和荧光叠加成像

Fig.7 Fluorescence imaging of （A） A549 cells，（B） HCT116 cells and （C） HepG2 cells incubated with the probe NA （30 μmol/L） for 30 min； D-F： merged images of A-C； λex=488 nm， λem=500~600 nm

图8 HepG2细胞的荧光成像：（A）细胞与探针NA（30 μmol/L）共孵育30 min；（B）细胞与SIN（800 μmol/L）孵育30 min，加入探针NA（30 μmol/L）继续孵育30 min；（C）细胞与LPS （20 μg/mL）和IFN-γ （300 ng/mL）孵育12 h，再加入探针溶液（30 μmol/L）继续孵育30 min；（D）细胞与TEMPO （1080 μmol/L）、LPS （20 μg/mL）和IFN-γ （300 ng/mL）共孵育12 h，加入探针溶液（30 μmol/L）继续孵育30 min；E-H分别为A-D的明场和荧光叠加成像；λex=488 nm， λex=500~600 nm；（I）不同培养条件下细胞的相对荧光强度

Fig. 8 Fluorescence imaging of HepG2 cells：（A） incubated with the probe NA （30 μmol/L） for 30 min；（B） Incubated with SIN （800 μmol/L） for 30 min， and then incubated with the probe NA （30 μmol/L） for another 30 min；（C） Incubated with LPS （20 μg/mL） and IFN-γ （300 ng/mL） for 12 h， and then incubated with the probe NA （30 μmol/L） for another 30 min；（D） Incubated with TEMPO （1080 μmol/L）， LPS （20 μg/mL） and IFN-γ （300 ng/mL） for 12 h， and then incubated with the probe NA （30 μmol/L） for another 30 min；（E-H merged images of A-D； λex=488 nm， λex=500~600 nm；（I） The relative fluorescence intensity ratio under different culture conditions

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