氧杂蒽类荧光探针对ClO－的识别和细胞成像应用

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220071

摘要/Abstract

摘要：

对细胞生理环境下次氯酸根离子（ClO^－）进行高效识别在生理学和病理学研究方面具有重要意义。通过连续的碳碳双键连接二甲氨基取代的氧杂蒽结构与苯并噻唑结构，设计合成了一种新型荧光分子3，6-双（二甲胺基）-9-（1-（3-甲基-苯并噻唑））-三甲基））-氧杂蒽（R-1）。R-1在ClO^－存在下，600 nm处的荧光发射显著增强（量子产率高达20.3%），且其它活性氧物质不影响该探针对ClO^－的识别。荧光成像实验表明，探针R-1能够对人肺腺癌（A549）细胞内的ClO^－进行检测，并发出红色荧光，具有ClO^－生物成像的应用潜力。

关键词: 荧光探针, 氧杂蒽, 苯并噻唑, 次氯酸根离子, 荧光成像

Abstract:

Selective recognition of hypochlorite ion （ClO^－） in intracellular biological environment is important for research and application in cellular physiology and pathology. A novel fluorescent molecule， 6-bis（dimethylamino）-9-（1-（3-methyl-benzothiazole）-trimethyl）-xanthene （R-1）， is designed and synthesized with a combination of dimethylamino-substituted xanthene and benzothiazole segments through continuous carbon-carbon double bonds. In the presence of ClO^－， the fluorescence emission of R-1 at 600 nm is significantly enhanced （the quantum yield is as high as 20.3%）， and other reactive oxygen species do not affect the recognition of ClO^－. Fluorescence imaging experiments demonstrate that probe R-1 can detect ClO^－ in human lung adenocarinoma （A549） cells and emit red fluorescence， indicating the potential application of R-1 in ClO^－ biological imaging.

Key words: Fluorescent probe, Xanthene, Benzothiazole, Hypochlorite ion, Fluorescence imaging

中图分类号:

O625.6

于思为, 王良鹏, 金日哲, 康传清. 氧杂蒽类荧光探针对ClO^－的识别和细胞成像应用[J]. 应用化学, 2022, 39(12): 1903-1911.

Si-Wei YU, Liang-Peng WANG, Ri-Zhe JIN, Chuan-Qing KANG. Recognition of ClO^－ and Cellular Imaging with Xanthene-based Fluorescent Probes[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2022, 39(12): 1903-1911.

图/表 9

图 1 探针R-1的合成路线

Fig.1 Synthetic route of probe R-1

图 2 探针R-1（10 μmol/L）在甲醇/水溶液中和不同浓度的ClO－反应的紫外光谱（A）以及在650 nm处的紫外吸收强度随ClO－浓度的变化线性关系（B）

Fig.2 （A） UV-Vis absorption spectra of probe R-1 with different concentrations of sodium hypochlorite in methanol/water；（B） A linear plot of the UV absorption at 650 nm versus concentrations of ClO－

图 3 探针R-1（10 μmol/L）在甲醇/水溶液中随ClO－（0～20 μmol/L）浓度变化的荧光光谱（A）ClO－浓度从0 μmol/L升高到10 μmol/L；（B）ClO－浓度从10 μmol/L升高到20 μmol/L；内插图：探针R-1在600 nm处的荧光强度随ClO－浓度变化的线性关系图

Fig.3 Fluorescence spectra of probe R-1 （10 μmol/L） in response to various concentrations of ClO－（0～20 μmol/L） in methanol/water solutions（A） Concentration of ClO－ increased from 0 μmol/L to 10 μmol/L；（B） Concentration of ClO－ increased from 10 μmol/L to 20 μmol/L； Inset： linear plots of the fluorescence intensities of probe R-1 at 600 nm versus concentrations of ClO－

图4 探针R-1（10 μmol/L）在甲醇/水溶液中和次氯酸（10 μmol/L）反应后的荧光寿命

Fig.4 Fluorescence lifetime of probe R-1 （10 μmol/L） in response to ClO－（10 μmol/L） in methanol/water solutions

图5 探针R-1在甲醇/水溶液中对ClO－的选择性识别（A）探针R-1（10 μmol/L）在不同离子和氧化性物质存在下的荧光谱图；（B）探针R-1在不同离子和氧化性物质存在下在发射波长600 nm处的荧光强度；（C）自然光下，探针R-1在不同离子和氧化性物质存在下的颜色； ClO－浓度为10 μmol/L，其它离子和氧化性物质浓度为100 μmol/L

Fig.5 Selective recognition of probe R-1 to ClO－ in methanol/water solution（A） Fluorescence spectra of probe R-1 （10 μmol/L） in the presence of ions and reactive oxygen species in methanol/water；（B） Fluorescence intensity of probe R-1 at emission wavelength of 600 nm in the presence of ions and reactive oxygen species；（C） Color of probe R-1 in the presence of ions and reactive oxygen species； Concentration of ClO－ was 10 μmol/L， others were 100 μmol/L

图 6 探针R-1（A）和探针R-1和次氯酸钠反应后（B）的质谱图

Fig.6 Mass spectra of probe R-1 before （A） and after （B） reaction with sodium hypochlorite

图 7 探针R-1和次氯酸根反应的可能过程

Fig.7 Proposed response mechanism of probe R-1 to hypochlorite

图 8 探针R-1（A）和脂多糖（B）对A549细胞的细胞毒性

Fig.8 Cytotoxicity of probe R-1（A） and LPS（B） on A549 cells

图 9 探针R-1在A549细胞中的荧光成像（标尺：20 μm）第1行：对照组，A549细胞施加Hoechst 33342染色；第2行：A549细胞施加探针R-1及Hoechst 33342染色；第3行：LPS（1 μg/mL）孵育后的A549细胞施加探针R-1及Hoechst 33342染色；第4行：次氯酸钠水溶液（5 μmol/L）孵育后的A549细胞施加探针R-1及Hoechst 33342染色

Fig.9 Fluorescence imaging of probe R-1 in A549 cell line（scale bar： 20 μm）First row： A549 cells stained with Hoechst 33342； Second row： A549 cells stained with probe R-1 and Hoechst 33342； Third row： A549 cells stained with probe R-1 and Hoechst 33342 after incubated with LPS （1 μg/mL）； Fourth row： A549 cells were stained with probe R-1 and Hoechst 33342 after incubated with sodium hypochlorite aqueous solution （5 μmol/L）

参考文献 20

1	SIES H， BELOUSOV V V， CHANDEL N S， et al. Defining roles of specific reactive oxygen species（ROS） in cell biology and physiology［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2022， 23： 499-515.
2	ASHTON T D， JOLLIFFE K A， PFEFFER F M. Luminescent probes for the bioimaging of small anionic species in vitro and in vivo［J］. Chem Soc Rev， 2015， 44（14）： 4547-4595.
3	WU D， SEDGWICK A C， GUNNLAUGSSON T， et al. Fluorescent chemosensors： the past， present and future［J］. Chem Soc Rev， 2017， 46（23）： 7105-7123.
4	QIAO W， YAO P， CHEN Y， et al. Squaraine-based AIEgens for reversible mechanochromism， sensitive and selective hypochlorite detection and photostable far-red fluorescence cell imaging［J］. Mater Chem Front， 2020， 4： 2688-2696.
5	YANG Y， YIN C， HUO F， et al. Simple 1，8-diaminonaphthalene-based fluorescence chemosensor for hypochlorites and its practical application［J］. Sens Actuators B： Chem， 2014， 199： 226-231.
6	WU L， WU I C， DUFORT C C， et al. Photostable ratiometric pdot probe for in vitro and in vivo imaging of hypochlorous acid［J］. J Am Chem Soc， 2017， 139（20）： 6911-6918.
7	BEST Q A， SATTENAPALLY N， DYER D J， et al. pH-dependent Si-fluorescein hypochlorous acid fluorescent probe： spirocycle ring-opening and excess hypochlorous acid-induced chlorination［J］. J Am Chem Soc， 2013， 135（36）： 13365-13370.
8	YUAN L， LIN W， CHEN B， et al. Development of FRET-based ratiometric fluorescent Cu²⁺ chemodosimeters and the applications for living cell imaging［J］. Org Lett， 2012， 14（2）： 432-435.
9	ORDEIG O， MAS R， GONZALO J， et al. Continuous detection of hypochlorous acid/hypochlorite for water quality monitoring and control［J］. Electroanalysis， 2005， 17（18）： 1641-1648.
10	DONG W， SUN C， SUN M， et al. Fluorescent copper nanoclusters for the iodide-enhanced detection of hypochlorous acid［J］. ACS Appl Nano Mater， 2019， 3（1）： 312-318.
11	YANG X， WANG T， GUO J， et al. Dietary flavonoids scavenge hypochlorous acid via chlorination on A- and C-rings as primary reaction sites： structure and reactivity relationship［J］. J Agric Food Chem， 2019， 67（15）： 4346-4354.
12	HUANG T， YAN S， YU Y， et al. Dual-responsive ratiometric fluorescent probe for hypochlorite and peroxynitrite detection and imaging in vitro and in vivo［J］. Anal Chem， 2022， 94（2）： 1415-1424.
13	CHO M， NGUYEN V N， YOON J. Simultaneous detection of hypochlorite and singlet oxygen by a thiocoumarin-based ratiometric fluorescent probe［J］. ACS Meas Sci Au， 2022， 2（3）： 219-223.
14	WANG L G， MUNHENZVA I， SIBRIAN-VAZQUEZ M， et al. Altering fundamental trends in the emission of xanthene dyes［J］. J Org Chem， 2019， 84（5）： 2585-2595.
15	CHEN X， PRADHAN T， WANG F， et al. Fluorescent chemosensors based on spiroring-opening of xanthenes and related derivatives［J］. Chem Rev， 2012， 112（3）： 1910-1956.
16	PANDEY A， KUMAR A， VISHWAKARMA S， et al. A highly specific ‘turn-on’ fluorescent detection of Mg²⁺ through a xanthene based fluorescent molecular probe［J］. RSC Adv， 2016， 6（8）： 6724-6729.
17	ZHANG Y， MA L， TANG C， et al. A highly sensitive and rapidly responding fluorescent probe based on a rhodol fluorophore for imaging endogenous hypochlorite in living mice［J］. J Mater Chem B， 2018， 6（5）： 725-731.
18	SONG Z G， YUAN Q， LV P， et al. Research progress of small molecule fluorescent probes for detecting hypochlorite［J］. Sensors， 2021， 21（19）： 6326.
19	REJA S I， BHALLA V， SHARMA A， et al. A highly selective fluorescent probe for hypochlorite and its endogenous imaging in living cells［J］. Chem Commun， 2014， 50（80）： 11911-11914.
20	VONDENHOFF M F， VAN DE PAVERT S A， DILLARD M E， et al. Lymph sacs are not required for the initiation of lymph node formation［J］. Development， 2009， 136（1）： 29-34.

[1]	于红丽, 周思仪, 洪琛, 罗稳. 基于黄酮骨架的“关-开”型荧光探针用于检测活细胞内丁酰胆碱酯酶[J]. 应用化学, 2023, 40(4): 500-508.
[2]	耿佳美, 马素芳, 刘文, 刁海鹏, 武志芳, 李思进. 肝靶向荧光探针用于HepG2细胞中ONOO^-的特异性检测[J]. 应用化学, 2023, 40(3): 441-448.
[3]	薛松松, 解正峰, 何佳伟, 张天怡, 夏保平, 李雨芹. 高选择性快速识别汞（Ⅱ）离子的磺酰腙型探针的合成及在吸附中的应用[J]. 应用化学, 2022, 39(5): 760-768.
[4]	张松涛, 王樱蕙, 张洪杰. Nd³⁺离子敏化的荧光纳米探针用于近红外二区血管成像[J]. 应用化学, 2022, 39(4): 685-693.
[5]	黄蕊, 叶长青, 李亚军, 邱盟峯, 李达谅, 鲍红丽. 线粒体靶向的近红外HClO/ClO^－荧光探针的研究进展[J]. 应用化学, 2022, 39(3): 407-424.
[6]	张成路, 王一鸣, 任芷漩, 李露, 李雨晴, 宋府璐. 以苯并咪唑萘酰亚胺为荧光团高选择快速检测H₂S的荧光探针[J]. 应用化学, 2022, 39(3): 489-497.
[7]	张成路, 暴金迪, 于丰铭, 董文静, 张洋, 宫荣庆, 张彦朋, 张璐. 以喹唑啉酮为核心高选择高灵敏识别次氯酸根离子的荧光探针的合成及应用[J]. 应用化学, 2021, 38(8): 986-994.
[8]	黄译文, 王丽艳, 赵冰, 宋波. 一种水溶性甲氧基萘乙烯半菁合成及对铬(Ⅲ)离子的荧光检测[J]. 应用化学, 2021, 38(11): 1503-1511.
[9]	徐丽萍, 刘清士, 董芷辰, 郭兴家, 董微. 基于氮掺杂碳点的荧光增强简便、快速而准确地检测环丙沙星[J]. 应用化学, 2020, 37(7): 830-838.
[10]	蔡丰泽, 徐永玲, 周乐, 许丙嵩, 陈浩, 孙建强, 李迪, 王慧. 一种红光发射的粘度荧光探针[J]. 应用化学, 2020, 37(4): 440-446.
[11]	董子越, 周晓霞, 赵晓慧, 叶达莹, 安悦. 一种可用于检测2,4,6-三硝基苯酚的杂环芳族卤化物小分子荧光探针[J]. 应用化学, 2020, 37(3): 332-339.
[12]	董智云, 张晓宇, 曾政权, 席福贵. 基于蒽-苯并咪唑鎓的荧光传感器对H₂PO₄^-的高选择性识别[J]. 应用化学, 2020, 37(1): 80-87.
[13]	张莹莹, 王丽艳, 赵冰, 宋波. 基于苯并吲哚的荧光探针对Al³⁺的识别及应用[J]. 应用化学, 2020, 37(1): 88-95.
[14]	高漫, 何鑫, 崔京南, 刘涛, 田镇豪, 何深贵. 以香豆素为母体快速检测内源性甲醛的荧光探针[J]. 应用化学, 2019, 36(9): 1053-1060.
[15]	潘文慧,李文,屈璟涵,叶懿霈,屈军乐,杨志刚. 单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展[J]. 应用化学, 2019, 36(3): 269-281.