基于黄酮骨架的“关-开”型荧光探针用于检测活细胞内丁酰胆碱酯酶

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220308

摘要/Abstract

摘要：

以间苯二酚为起始原料，设计合成了一种基于N，N-二甲胺基萘取代的黄酮母核（3）为荧光报告基团的“关-开”型丁酰胆碱酯酶（BChE）荧光探针（4a），并通过核磁共振波谱（NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行了结构表征。结果表明，探针4a能够快速地对BChE产生特异性响应，在pH=8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）中，574 nm处荧光强度明显增强，同时肉眼可见溶液颜色的改变。通过高效液相色谱（HPLC）和HRMS对响应机理进行了探讨，发现BChE可使探针的酯键发生断裂，生成具有强荧光的黄酮母核（3）。此外，探针4a可用于检测人肝癌细胞（HepG2）中的BChE并进行荧光成像。

关键词: 黄酮, 丁酰胆碱酯酶, 荧光探针

Abstract:

An “off-on” fluorescence probe （4a） based on N，N-（dimethylamino）naphthalenyl flavone （3） is designed and synthesized for detection of butyrylcholinesterase （BChE） by using resorcinol as starting materials. The structure of the probe is identified by nuclear magnetic resonance spectroscopy （NMR） and high resolution mass spectrometry （HRMS）. The results show that probe 4a could react rapidly and specifically with BChE， and its fluorescence intensity increases obviously at 574 nm in PBS of pH 8.0. Meanwhile， the color change of the solution can be seen by naked eyes. The response mechanism is explored through high performance liquid chromatography （HPLC） and HRMS. The results reveal that BChE catalyzes the cleavage of the ester bond， and strongly fluorescent flavone 3 is released. In addition， probe 4a could be used for fluorescence imaging of BChE in living human hepatocellular carcinoma （HepG2） cells.

Key words: Flavone, Butyrylcholinesterase, Fluorescence probe

中图分类号:

O657.3

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图/表 10

图1 已报道的部分丁酰胆碱酯酶探针（A-E）和黄酮类探针（F-J）的化学结构

Fig.1 Chemical structures of some reported BChE probes （A-E） and flavone probes （F-J）

图2 化合物4a和4b的合成路线

Fig.2 Synthetic route of compounds 4a and 4b

图3 在有/无BChE （43.6 U/mL）存在情况下，探针4a （10 μmol/L）在PBS中的吸收光谱（A）和荧光光谱（B）

Fig.3 Absorption （A） and fluorescent spectra （B） of probe 4a （10 μmol/L） with or without BchE （43.6 U/mL） in PBS

图4 在不同量BChE存在下，探针4a（10 μmol/L）在PBS中的574 nm荧光强度与反应时间的关系图（λex= 430 nm，狭缝： 2.0/0.5 nm）

Fig.4 A plot of fluorescence intensity at 574 nm vs the reaction time for the probe 4a （10 μmol/L） in PBS in the presence of different amounts of BChE （λex= 430 nm， slit： 2.0/0.5 nm）

图 5 探针4a （10 μmol/L）对PBS中各种分析物的荧光变化倍数

Fig.5 The fluorescence change multiple of probe 4a （10 μmol/L） toward various analytes in PBS

图6 探针4a （10 μmol/L）与BChE （43.6 U/mL）的荧光强度（574 nm）以及PBS中共存的各种小分子（50 μmol/L）的干扰

Fig.6 Fluorescence intensity （574 nm） of probe 4a （10 μmol/L） with BChE （43.6 U/mL） and the interference of coexisting various small molecules （50 μmol/L） in PBS

图7 在有/无BChE （43.6 U/mL）存在情况下，pH值对探针4a （10 μmol/L）的荧光强度（574 nm）的影响

Fig. 7 Effects of pH value on the fluorescence intensity （574 nm） of probe 4a （10 μmol/L） with or without BChE （43.6 U/mL）

图8 BChE探针4a的识别机制

Fig.8 The recognition mechanism of probe 4a for BChE

图 9 探针4a与HepG2细胞孵育24 h后的MTT测定

Fig.9 MTT assay of probe 4a and HepG2 cells after 24 h incubation

图 10 探针4a （10 μmol/L）在HepG2活细胞中对BChE的反应

Fig.10 Response of BChE by probe 4a （10 μmol/L） in living HepG2 cells pretreated without （A-C） or with tacrine （D-F）.（A）.（D） dark field，（B）.（E） bright field，（C）.（F） merged

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