四面体框架核酸对脑靶向肽分子的可控组装及性能

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220038

摘要/Abstract

摘要：

通过设计带手臂链的四面体框架核酸，组装1～3条肽段修饰的手臂链的互补链，以及组装不同种类的脑靶向肽修饰的互补链，比较其毒性、细胞靶向摄取，探讨肽链的数量和种类对四面体DNA纳米探针脑靶向的影响。结果发现，在100 nmol/L浓度范围内，探针无细胞毒性。细胞在不同时间段内对脑靶向Angiopep-2（ANG）肽链修饰的四面体探针的摄取量与单纯四面体比较有显著性差异（P<0.01），在与脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞共孵育0.5 h，与脑胶质瘤细胞U87共孵育1 h，四面体框架核酸组装3条肽链被摄取的量明显比组装1条肽链的摄取量多（P<0.01），但在与细胞共孵育2 h后，组装不同数量肽的探针在细胞内的摄取量没有显著差异。除此外，组装相同数量的噬菌体展示肽TGN和细胞穿膜肽TAT后，组装肽的四面体探针细胞摄取量比单纯四面体细胞内显著升高（P<0.01），但3种肽链组装的四面体探针在bEnd.3中细胞摄取量并无显著差异。这些结果表明，肽链的数量可能影响短时间内细胞对其摄取的速率，但并不影响2 h后细胞对探针的摄取总量，这一发现可有效节省出四面体修饰位点，为四面体框架核酸的更多功能修饰提供借鉴，在修饰单个靶向肽延长作用时间达到靶向目的的同时，可增加其它位点的功能化修饰，使其结构功能最大化，而且DNA框架核酸还可以作为其它脑靶向肽TGN和TAT的载体。

关键词: 四面体框架核酸, 脑靶向探针, 可控组装, 靶向摄取

Abstract:

In this study， the armed tetrahedral DNA nanostructures （TDN） are designed to bind single or three complementary strands of armed chain （1-ANG-TDN， 3-ANG-TDN） which is modified with angiopep-2 or other brain targeting peptides （TAT， TGN）. We compare the cell viability and cellular uptake of 1-ANG-TDN or 3-ANG-TDN in brain capillary endothelial （bEnd.3） cells and Uppsala 87 malignant glioma （U87） cells. In addition， the cell viability and cellular uptake of ANG-TDN， TAT-TDN and TGN-TDN in bEnd.3 cells are investigated respectively. The results show that these probes are not cytotoxic to bEnd.3 cells and U87 cells at concentrationsbelow 100 nmol/L. After being incubated with bEnd.3cells for 0.5 h， the cellular uptake of 3-ANG-TDN is higher than that of 1-ANG-TDN （P<0.01）. After being incubated with U87 cells for 1h， the cellular uptake of 3-ANG-TDN is higher than that of 1-ANG-TDN （P<0.01）. After 2 h， there is no obvious difference in cellular uptake between 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN. ANG-TDN， TAT-TDN and TGN-TDN are up-taken by bEnd.3 cells much more than TDN （P<0.01）. However， there isno statistical difference among ANG-TDN， TAT-TDN and TGN-TDN （P>0.05）. These results indicate that the targeting of ANG-TDN probe can be improved by increasing the number of peptides or prolonging the co-incubation time. This discovery providesareference for the multifunctional modification of tetrahedral framework nucleic acid. When a single peptidelinked with TDN achieves the brain targeting， other sites of TDN can be modified by other functional groups to expand the structure and function. Tetrahedral framework nucleic acids can be used not only as an assembly platform for ANG peptides， but also for the assembly of other brain-targeting peptides （TAT and TGN） to design brain-targeting probes.

Key words: Tetrahedral framework nucleic acid, Brain-targeting probes, Controllable assembly, Targeted uptake

中图分类号:

O655

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图/表 4

图1 不同数量肽链修饰的四面体DNA纳米结构的表征A.探针结构示意图； B.不同数量肽链修饰的四面体探针的PAGE凝胶电泳（1道： Marker； 2道： TDN； 3道： Armed-TDN； 4道： 1-ANG-TDN； 5道： 3-ANG-TDN）； C. 四面体框架核酸的AFM表征图； D. 组装靶向肽的四面体框架核酸探针的AFM表征图

Fig.1 Structural characterization of tetrahedral DNA nanostructures modified with different numbers of Angiopep-2-peptides（ANG）A. Schematic diagram of the probe structures； B. PAGE analysis of tetrahedral DNA nanostructures modified with different numbers of Angiopep-2 peptides （line 1： DNA marker， line 2： TDN， line 3： armed-TDN， line 4： 1-ANG-TDN，line 5： 3-ANG-TDN）； C. AFM images of TDN； D. AFM images of ANG-TDN

图2 不同数量ANG修饰的四面体DNA纳米结构的细胞毒性A-C. 不同浓度的TDN、1-ANG-TDN和3-ANG-TDN与bEnd.3细胞孵育24 h的细胞存活率； D-F. 不同浓度TDN、1-ANG-TDN和3-ANG-TDN与U87细胞共孵育24 h的细胞存活率

Fig.2 Cytotoxicity of tetrahedral DNA （TDN） modified with different numbers of ANG peptides （ANG-TDN）A-C. Cell viability of bEnd.3 cellsafter incubating with TDN， 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN cells for 24 h； D-F. Cell viability of U 87 cells after incubating with TDN， 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN for 24 h

图3 TDN、1-ANG-TDN、3-ANG-TDN与bEend.3及U87细胞共孵育后的细胞摄取A-C. bEend.3细胞对TDN、1-ANG-TDN和3-ANG-TDN探针摄取的激光共聚焦l图（4 h）、流式分析（0.5、1、2、4 h）及统计分析图（0.5、1、2 h）； D-F. U87细胞对TDN、1-ANG-TDN和3-ANG-TDN探针摄取的激光共聚焦图、流式分析及统计分析图（* 表示P<0.05，** 表示P<0.01，ns表示P>0.05）

Fig.3 Cell uptake of TDN， 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN in bEend.3 and U87 cellsA-C. Confocal images（4 h）， flow analysis（0.5，1，2，4 h） and statistical analysis （0.5， 1， 2 h） of cellular uptake of TDN， 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN in bEend.3 cells. D-F. Confocal images， flow analysis and statistical analysis of cellular uptake of TDN， 1-ANG-TDN and 3-ANG-TDN in U87 cells. In （B），（C），（E），（F）， Mean Fluorescence Intensity， MFI.（* represents P<0.05，** represents P<0.01，ns represents P>0.05）

图4 不同脑靶向四面体框架核酸探针（TGN-TDN、ANG-TDN和TAT-TDN）的结构表征、细胞毒性及细胞摄取A. TGN-TDN、ANG-TDN和TAT-TDN的PAGE凝胶电泳图（1道：DNA Marker；2道：TDN；3道：Armed-TDN；4道：TGN-TDN；5道：ANG-TDN；6道：TAT-TGN）。 B-C. TGN-TDN和TAT-TDN的细胞毒性。 D. bEnd.3细胞对TDN、TGN-TDN、ANG-TDN和TAT-TDN摄取的激光共聚焦图。 E.bEnd.3细胞对TGN-TDN、ANG-TDN和TAT-TDN摄取的统计图（** 表示P<0.01， ns表示P>0.05）

Fig.4 Structural characterization， cytotoxicity and cellular uptake of different brain targetedframe nucleic acid probes（TGN-TDN， ANG-TDN and TAT-TDN）A. PAGE gel electrophoresis analysis of TGN-TDN， ANG-TDN and TAT-TDN （line 1： DNA marker， line 2： TDN， line 3：Armed-TDN， line 4： TGN-TDN， line 5： ANG-TDN， line 6： TAT-TDN）. B-C. Cytotoxicity of TGN-TDN， ANG-TDN and TAT-TDN. D. Cellular uptake of TGN-TDN， ANG-TDN and TAT-TDN in bEnd.3 cells. E. Statistical analysis of cellular uptake of TDN， TGN-TDN，ANG-TDN and TAT-TDN in bEnd.3 cells（* represents P<0.05，** represents P<0.01，ns represents P>0.05）

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