商品化血糖仪用于乙型肝炎病毒的便携式体外分子诊断

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.210182

摘要/Abstract

摘要：

为解决当前乙型肝炎病毒（HBV）基因检测技术在一定程度上存在成本高、操作繁琐、误诊率高等问题，在此提出了一种便携式生物传感平台用于HBV基因的超灵敏检测，可检出低至2 copies/μL的HBV基因。首次通过设计针对HBV检测序列的环介导等温扩增（LAMP）反应，实现了在40 min之内对HBV基因型单拷贝基因的检测。然后，通过在磁球上固定LAMP产物的捕获探针FP（F-Probe），同时在与FP部分互补的FPc（Complementary probe of F-Probe）链上修饰耐热蔗糖转化酶（Inv）构成Inv-FPc信号探针，Inv-FPc与FP杂交后组成信号转导探针。HBV基因的LAMP扩增产物与信号转导探针发生核酸链置换反应，使Inv-FPc信号探针脱离信号转导探针，磁性分离后溶液中的Inv-FPc信号探针可催化蔗糖转化为葡萄糖，最后通过血糖仪进行信号输出，即可间接实现对HBV基因的超灵敏检测。结果表明，所构建的生物传感平台在10~500 nmol/L浓度范围内对HBV基因片段具有良好的信号响应。选用诺如病毒基因对传感器的检测特异性进行验证，其信号与背景信号几乎一致。最后，通过对含10%体积分数人血清中的HBV基因进行检测，传感器依然展现了良好的“是/否”的特异性信号响应。为HBV的分子诊断提出一种新思路，所提出的新式传感器有望应用于HBV的现场即时（point-of-care，POC）诊断。

关键词: 环介导等温扩增, 血糖仪, 乙型肝炎病毒, 现场即时诊断

Abstract:

The current detection methods for hepatitis B virus （HBV） require high cost， complicated manipulation and are usually with high misdiagnosis rate. All the above issues have inspired us to develop a portable biosensing platform for the HBV detection. The loop-mediated isothermal amplification （LAMP） reaction designed for HBV sequence contributes to the single copy gene detection within 40 min. The immobilization of capture probe F-Probe （FP） on the magnetic beads （MBs） and the modification of FPc （partially complementary to FP） with heat-resistant invertase （Inv） collectively constitute the Inv-FPc signal probe， and the hybridization of Inv-FPc and FP creates the signal transduction probe， which with the HBV LAMP amplicons would induce the replacement of nucleic acid chains， isolating the Inv-FPc from the signal transduction probe. The Inv-FPc signal probe in the solution after magnetic separation would catalyze the transformation of sucrose into glucose that is read by glucometer. The experimental results show that the qualified signal response is in the concentration range of 10~500 nmol/L of HBV gene segments. Almost concordant signal and background are observed when employing Norovirus （NoV） gene as the target. The biosensor presents a perfect “yes/no” signal response in 10% human serum and has a potential to be applied in point of care diagnosis of HBV.

Key words: Loop-mediated isothermal amplification, Glucometer, Hepatitis B virus, Point-of-care testing

中图分类号:

O655.9

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图/表 6

表1 本工作中用到的核酸序列

Table 1 Oligonucleotide sequences used in this work

名称	DNA序列（5' to 3'）
Name	DNA sequences （5' to 3'）
HBV?BIP	TTGGATGTTGGGGTACTTTACCGAGGTCTATTTACAGGCAGTT
HBV?FIP	TCCCATGAAGTTAAGGGAGTAGCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTA
HBV?F3	TTGAGTCCCTTTTTACCTCTA
HBV?B3	TCTCTGACATACTTTCCAATCA
HBV?LP	CAAGAACATATTGTACTAAAAATCAAGCAATGTTTTCGAA
HBV mimic	TACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGG
NoV?BIP	ATCAATCACTGAAGGGCTCCCCTGAGGAGCCAATGAGCAATG
NoV?FIP	TCCATCACGCTGGGAGATAGGAATTTTCCCCAGAACCACACC
NoV?B3	ACCTCAGAGAGTGCACAGAG
NoV?F3	CTGCAGCCCTGGAGATCA
NoV mimic	TCTGGGGTGCCTTGCACTTCACAATGGAATTC
FPc	CGACCCCAACGTTTGGTTTTATTAGGGTTTAAATGTAAAAAAAAAAA/SH?SH C6/
FP	TAATAAAACCAAACGTTGGGGTCGAAAAAAAAAA/biotin/

图1 环介导等温扩增技术与核酸分子线路相结合应用于血糖仪中用于HBV检测的示意图

Fig.1 Schematic illustration of coupling loop mediated isothermal amplification with nucleic acid circuit to glucometer for HBV detection

图2 （A）不同温度下的酶促反应动力学过程；（B）不同反应温度下的检测信噪比

Fig.2 （A） The kinetics of enzyme reaction at different temperatures；（B） Signal-to-noise ratio at different reaction temperature

图3 （A）血糖仪对0~500 nmol/L 浓度范围内HBV mimic的信号响应；（B）传感器对不同病毒模拟物的选择性和灵敏度检测

Fig.3 （A） Signal response of glucometer to different concentrations of HBV mimic from 0~500 nmol/L；（B） Selectivity and sensitivity detection of different concentration of HBV and NoV mimics

图4 （A）不同浓度HBV模板的时间-荧光曲线；（B）琼脂糖凝胶电泳表征LAMP扩增之后的产物

Fig.4 （A） The function of time with varying amounts of the HBV templates；（B） Agarose gel electrophoretic characterization of LAMP amplicons

图5 （A）对等温扩增缓冲溶液中的LAMP扩增产物的检测；（B）对血清中的LAMP扩增产物的检测Fig. （A） Detection of LAMP products in isothermal amplification buffer；（B） Detection of LAMP products in serum

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