氧化石墨烯-DNA纳米探针用于三磷酸腺苷的检测与药物递送

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.230012

摘要/Abstract

摘要：

癌细胞内三磷酸腺苷（ATP）浓度异常与肿瘤发生发展过程密切相关，因此，快速、准确地检测细胞内外ATP水平具有重要意义。盐酸阿霉素（DOX）是一种广泛使用的抗癌药物，能嵌入DNA碱基对，并通过抑制DNA复制和转录诱导细胞凋亡。氧化石墨烯（Graphene oxide， GO）由于具有毒性低、比表面积大和易功能化，可以有效、稳定地负载DNA纳米探针进入细胞等优点而被广泛应用。然而，复杂环境中的生物分子容易通过物理吸附竞争性结合到GO表面，导致假阳性信号。基于此，提出了一种新型的GO-DNA纳米探针，并将其应用于ATP的检测与抗癌药物DOX靶向递送。以ATP的核酸适配体与其互补链杂交形成双链DNA（dsDNA），并通过G-C碱基对负载DOX，利用互补链延伸的poly A序列吸附到GO表面构建了GO-dsDNA-DOX纳米探针，能极大程度地降低复杂环境中物理吸附引起的干扰，减少假阳性信号产生。ATP与适配体特异性结合会导致DOX释放，根据其荧光“off-on”实现ATP的定量分析，DOX荧光强度与ATP含量在0.08~8.0 mmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I_F=3.0897c+129.08，检测限（3σ/k）为0.059 mmol/L，且方法具有良好的选择性和抗干扰能力。细胞毒性及荧光成像结果表明，负载DOX的纳米探针在人乳腺癌细胞（MCF-7）内有明显的药物释放，显著诱导细胞凋亡。该研究建立了一种免修饰、简单和快速的ATP含量检测分析方法，并利用癌细胞内高浓度ATP实现靶向药物递送，降低了对正常细胞的毒副作用，为癌症的治疗提供了新思路。

关键词: 三磷酸腺苷, DNA纳米探针, 氧化石墨烯, 荧光检测, 盐酸阿霉素, 药物递送

Abstract:

The abnormal concentration of adenosine 5-triphosphate （ATP） in cancer cells is closely related to the process of tumorigenesis and development. Therefore， rapid and accurate detection of ATP level in and out of cells is of great significance. Graphene oxide （GO） is widely used owing to its advantages of low toxicity， large specific surface area， easy functionalization， efficient and stable loading of DNA nanoprobes into cells. However， ssDNA bound to GO by physical adsorption is easily displaced by biomolecules in complex biological environment， leading to false positive signals. Based on this， a novel GO-DNA nanoprobe is proposed and applied to the detection of ATP and targeted delivery of the anticancer drug doxorubicin hydrochloride （DOX）. Double stranded DNA （dsDNA） is formed by hybridization of aptamer of ATP with complementary strand， and then DOX is loaded by G-C base pair to form dsDNA-DOX. dsDNA-DOX is adsorbed on GO surface through polyA sequence extended by complementary strand to construct GO-dsDNA-DOX nanoprobes， which could greatly reduce false positive signal caused by the physical adsorption of biomolecules in complex environment. The specific binding of ATP to aptamer can lead to the release of DOX， and quantitative analysis of ATP is achieved according to its fluorescence “off-on”. DOX fluorescence intensity shows a good linear relationship with the ATP content within the range of 0.08~8.0 mmol/L， and the linear equation is I_F=3.0897c+129.08. The detection limit （3σ/k） is 0.059 mmol/L， and the method has good selectivity and anti-interference ability. Cytotoxicity and fluorescence imaging results show that the DOX-loaded nanoprobes have significant drug release in MCF-7 cells and significantly induce apoptosis. This study establishes a label-free， simple and rapid method for ATP content detection and realizes targeted drug delivery by the high content of ATP in cancer cells， which reduces the toxic and side effects on normal cells and provides a new idea for cancer treatment.

Key words: Adenosine 5-triphosphate, DNA nanoprobe, Graphene oxide, Fluorescence detection, Doxorubicin hydrochloride, Drug delivery

中图分类号:

O655

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图/表 6

图1 GO-dsDNA-DOX探针构建及用于ATP检测和DOX靶向递送示意图

Fig.1 Schematic illustration for the construction of GO-dsDNA-DOX nanoprobe for ATP detection and targeted DOX delivery

图2 GO-dsDNA-DOX对ATP的响应及盐稳定性考察。（A） GO-dsDNA-DOX与ATP反应前后的荧光光谱；（B） GO-dsDNA-DOX与ATP反应前后的Zeta电位分析；（C） GO-dsDNA-DOX的盐稳定性

Fig.2 Investigation on the ATP response and salt stability of GO-dsDNA-DOX nanoprobe. （A） Fluorescence spectra of GO-dsDNA-DOX before or after reaction with ATP；（B） Zeta potential analysis of GO-dsDNA-DOX before or after reaction with ATP；（C） Salt stability of GO-dsDNA-DOX

图3 实验条件的优化。（A） DOX负载温度；（B） GO浓度；（C） GO吸附温度；（D） GO吸附时间；（E） ATP反应时间；（F）反应缓冲液的pH值（误差棒代表3次重复实验的标准偏差）

Fig.3 Optimization of experiment conditions. （A） DOX loading temperature；（B） Concentration of GO；（C） Adsorption temperature of GO；（D） Adsorption time of GO；（E） ATP reaction time；（F） pH of buffer （Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

图4 GO-dsDNA-DOX探针用于ATP检测及其选择性和抗干扰能力考察。（A） GO-dsDNA-DOX对不同浓度ATP的荧光响应；（B）荧光强度与ATP浓度之间的线性关系；（C） GO-dsDNA-DOX探针对ATP检测的选择性；（D） GO-dsDNA-DOX探针的抗干扰能力（误差棒代表3次重复实验的标准偏差）

Fig.4 Detection， specificity and anti-interference of GO-dsDNA-DOX probe for ATP assay. （A） Fluorescence response of the GO-dsDNA-DOX to different ATP concentrations；（B） The linear relationship between fluorescence intensity and ATP concentrations；（C） Specificity for the detection of ATP；（D） Anti-interference of probe （Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

图5 抗酶解能力考察与细胞毒性。（A） GO-dsDNA-DOX探针抗酶解能力考察；（B）不同浓度的GO-dsDNA-DOX探针对MCF-7细胞存活率的影响（误差棒代表3次重复实验的标准偏差）

Fig.5 Analysis of nuclease stability and cytotoxicity of GO-dsDNA-DOX probe. （A） Investigation on stability of probe against nuclease；（B） Cytotoxicity of MCF-7 cells incubated with different concentrations of probes （Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

图6 GO-dsDNA-DOX在MCF-7细胞中的荧光成像。第1列：未处理的细胞；第2列：细胞与DOX孵育；第3列：细胞与GO-dsDNA-DOX孵育；第4列：细胞与GO-dsDNA-DOX-oligomycin孵育

Fig.6 Fluorescence images of the GO-dsDNA-DOX in MCF-7 cells. Line 1： control cells； Line 2： cells incubated with DOX； Line 3： cells incubated with GO-dsDNA-DOX； Line 4： cells incubated with GO-dsDNA-DOX-oligomycin

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