基于金纳米粒子聚集与杂交链式扩增的microRNA传感

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220401

摘要/Abstract

摘要：

MicroRNA（miRNA）是癌症早期诊断的标志物，在生理和病理过程中发挥着关键作用，因此对miRNA的实时准确监测具有重要意义。目前，用于miRNA测定的信号放大/扩增策略多依赖于辅助酶的参与。本文建立了一种基于金纳米粒子（AuNPs）聚集和杂交链式反应（HCR）无酶扩增的高灵敏、特异性miRNA检测方法。为此，设计了一个辅助发夹探针（HP）和两个通用发夹探针（H1/H2），均为单链DNA（ssDNA）且具有粘性末端，可稳定水溶液中的AuNPs而有效防止盐诱导其聚集。靶miRNA与HP环区杂交，启动HCR触发双链DNA（dsDNA）聚合物的形成。dsDNA聚合物无粘性末端，对AuNPs的稳定能力减弱，从而产生盐诱导的AuNPs聚集，导致金胶体溶液由酒红色至蓝色的变化。据此可对miRNA进行光度法检测。该策略无需依赖酶促反应、分离过程及化学修饰，操作简单。通过设计HP环区序列，即可实现对不同靶标的检测，具有通用性。

关键词: 金纳米粒子, 杂交链式反应, 聚集, 比色法

Abstract:

MicroRNA （miRNA） is the marker for early diagnosis of cancer and plays a key role in physiological and pathological processes， therefore real-time and accurate monitoring of miRNA is of great significance. Currently， signal amplification/magnification strategies for miRNA assay are mostly dependent on the involvement of coenzymes. In this paper， a highly sensitive and specific miRNA detection method based on gold nanoparticle （AuNPs） aggregation and hybridization chain reaction （HCR） enzyme-free amplification is established. An assisted hairpin probe （HP） and two universal hairpin probes （H1/H2） are designed. Both of them are single-stranded DNA （ssDNA） with sticky ends， which could stabilize AuNPs in aqueous solution and effectively prevent salt-induced aggregation. The target miRNA hybridizes with the HP loop region， initiating HCR to trigger the formation of double-stranded DNA （dsDNA） polymers. The dsDNA polymer has no sticky ends and no ability to stabilize gold nanoparticles， resulting in salt-induced aggregation of AuNPs， and the change of gold-colloidal solution from wine red to blue. Thus， miRNA can be detected by spectrophotometry. This strategy does not rely on enzymatic reactions， separation processes， and chemical modifications， and operation is simple. By designing the HP loop sequence， the detection of different targets can be realized and show good versatility.

Key words: Gold nanoparticles, Hybridization chain reaction, Aggregation, Colorimetry

中图分类号:

O655

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图/表 8

表1 研究中所用的寡核苷酸序列

Table 1 The sequences of oligonucleotides adopted in the present study

Oligonucleotide	Sequence （5'-3'）
H1	TATGGCTGGGAGTGTCGCATGCTAGCGACACTCCCA
H2	GCGACACTCCCAGCCATATGGGAGTGTCGCTAGCAT
HP₂₁	GCGACACTCCCAGCCATATCAACATCAGTCTGATAAGCTATATGGCTGGG
HP₃₁	GCGACACTCCCAGCCATATCAACATCAGTCTGATAAGCTATATGGCTGGG
miRNA-21	UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-31	AGGCAAGATGCTGGCATAGCT
miRNA-let-7a	TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT
miRNA-10b	TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG
miRNA-155	TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT

图1 基于金纳米粒子聚集状态变化和杂交链反应扩增的高灵敏比色检测miRNA原理

Fig.1 Schematic illustration for high sensitive colorimetric detection of miRNA based on the aggregation of gold nanoparticles （AuNPs） and hybridization chain reaction （HCR） amplification

图2 （A）靶miRNA-21浓度为0和5 nmol/L时，比色检测系统的UV-Vis光谱。插图中给出的为AuNPs溶液的照片。（B）凝胶电泳图像。从左到右的泳道： 1-DNA marker； 2-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； 3-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L靶miRNA-21； 4-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L 靶miRNA-21。（C）无靶miRNA-21与100 mmol/L NaCl共存时，比色检测系统的TEM图像；插图为AuNPs的TEM粒径分布图。（D）5 nmol/L靶miRNA-21与100 mmol/L NaCl共存时，比色检测系统的TEM图像

Fig.2 （A） UV-Vis absorption spectra for the colorimetric detection system in the absence and presence of 5 nmol/L target miRNA-21. Inset illustrated the photographs of AuNPs solution. （B） Polyacrylamide gel electrophoresis images. From left to right， lane 1： DNA marker； lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； lane 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L Target miRNA-21； lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； lane 5： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L Target miRNA-21. （C） TEM images of AuNPs in the absence of target miRNA-21 （The inset represents the TEM size distribution of AuNPs）. （D） TEM images of AuNPs in the presence of 5 nmol/L target miRNA-21

图3 （A） HCR反应时间对传感系统性能的影响。（B） H1/H2浓度对AuNPs聚集的影响。（C）氯化钠浓度对AuNPs聚集及比色反应的影响。（D） AuNPs浓度对传感系统响应的影响。红色柱：对照实验；绿色柱：含有5.0 nmol/L的靶miRNA。（E）温度对HCR反应效率的影响。泳道1： DNA mark er； 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L 靶miRNA-21； 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 n mol/L HP21+50 nmol/L靶miRNA-21，对应温度依次为4、20、25、37和44 ℃。（F）图3E中泳道5-9剩余H1/H2条带的强度柱状图。（G）缓冲溶液pH值对HCR反应效率的影响。泳道1： DNA marker； 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L靶miRNA-21； 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L靶miRNA-21，对应pH值依次为： 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。（H）图G中泳道5-9剩余H1/H2条带的强度柱状图。误差线表示3次重复实验的标准偏差

Fig 3 （A） The effect of HCR reaction time on the sensing performance. （B） The effect of H1/H2 concentration on the aggregation of AuNPs and the sensing performance. （C） The effect of NaCl concentration on the aggregation of AuNPs and the performance of colorimetric reaction. （D） The effect of AuNPs concentration on the response of the sensing system. Red columns： control experiments； green columns： with 5.0 nmol/L of target miRNA. （E） The effect of temperature on HCR reaction efficiency. Lane 1： DNA marker； Lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； Lane 3 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L target miRNA-21； Lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； Lanes 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L target miRNA-21 at 4， 20， 25， 37 and 44 ℃， respectively. （F） Histogram of the intensity of the residual H1/H2 bands in lanes 5-9 as indicated in Fig.3E. （G） The effect of buffer pH value on HCR reaction efficiency. Lane 1： DNA marker； Lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； Lane 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L target miRNA-21； Lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； Lanes 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L target miRNA-21， corresponding to pH vales of 6.0， 6.5， 7.0， 7.5 and 8.0， respectively. （H） Histogram of the intensity of the residual H1/H2 bands as indicated in lanes 5-9 in Fig.3G. The error bars represent the standard deviation of triplicate detections

图4 （A）不同浓度靶miRNA-21存在下检测体系比色响应的照片。从左到右靶标miRNA-21的浓度依次为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 nmol/L。（B）不同浓度靶miRNA-21存在时的紫外-可见吸收光谱，随着miRNA浓度的增大，523 nm处的吸光度明显降低。（C）靶miRNA-21浓度与吸光度A523关系图；插图为0.05~0.50 nmol/L浓度范围内，吸光度与miRNA浓度的线性关系。（D）传感体系对靶miRNA-21的特异性检测。miRNA浓度为5.0 nmol/L。（E）血清中含有的BSA、Lys、Glu和Cys等对miRNA-21测定的干扰实验。BSA、Lys、Glu和Cys的浓度分别为1 μmol/L、1 mmol/L、1 μg/mL和5 g/L。误差棒为3次重复实验的标准偏差

Fig.4 （A） The photographs of colorimetric response of the detection system in the presence of different concentrations of target miRNA-21. From left to right the concentrations of target miRNA-21were 0， 0.05， 0.1， 0.2， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 4.0 and 6.0 nmol/L. （B） UV-visible absorption spectra of the sensing system in the presence of various concentrations of miRNA-21. （C） The relationship between target miRNA-21 concentration and absorbance A523 （The inset represents the linear calibration within a concentration range of 0.05~0.5 nmol/L）. （D） The specific detection of target miRNA-21 by sensing system. The concentration of miRNA was 5.0 nmol/L. （E） Anti-interference test for the detection of miRNA-21 in the presence of BSA， Lys， Glu and Cys contained in serum. The concentrations of BSA， Lys， Glu and Cys were 1 μmol/L， 1 mmol/L， 1 μg/mL and 5 g/L， respectively. The error bars represent the standard deviation of three repetitive detections

表2 不同miRNA检测方法的比较

Table 2 Comparison of different miRNA detection methods

Target	Detection method	Linear range/（nmol·L^-1）	Detection limit/（pmol·L^-1）	Ref.
miRNA-21	Colorimetric method	0～10	2 600	［20］
miRNA-155	Colorimetric method	1～100	700	［21］
miRNA-146a	Colorimetric method	0.38～40	1 300	［22］
miRNA-34c	Colorimetric method	0～0.1	5	［23］
miRNA-let-7a	Colorimetric method	0～400	63.2	［24］
miRNA-21	Colorimetric method	0.05～0.5	15	This work

图5 （A）靶miRNA-31的浓度与吸光度A523关系图；插图为0.05~0.50 nmol/L浓度范围内，靶miRNA-31浓度与吸光度之间的线性关系。（B）传感体系对靶miRNA-31的特异性检测。miRNA浓度为5.0 nmol/L

Fig.5 （A） The relationship between target miRNA-31 concentration and absorbance A523 （The inset represents the linear calibration within a concentration range of 0.05~0.50 nmol/L）. （B） The specific detection of target miRNA-31 by the sensing system. The concentration of miRNA was 5.0 nmol/L

表3 稀释的人血清样品中miRNA-21与miRNA-31的测定与回收率（n=3）

Table 3 The spiking recovery of miRNA-21 and miRNA-31 in diluted human serum samples （n=3）

Target	Sample	Added/（pmol·L^-1）	Found/（pmol·L^-1）	Recovery/%	RSD/%
miRNA-21	1	50	55.8	112	2.3
	2	100	104.7	105	1.7
	3	150	146.3	98	1.2
miRNA-31	1	50	45.5	91	1.8
	2	100	101.0	101	2.7
	3	150	166.7	111	2.1

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