婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.230216

摘要/Abstract

摘要：

研究了离子色谱法同时测定婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖的含量及影响因素。采用离子色谱柱分离，脉冲安培检测器检测和外标法定量分析等方法。通过对不同净化方式、酶解处理和洗脱条件等过程进行考察和优化，比较确定色谱条件和前处理条件对分离的影响，并就线性范围进行探讨。结果表明，优化后的方法线性关系良好， R²＞0.999；方法精密度好，相对标准偏差（n=7）＜2.7%；方法准确度好，2′-岩藻糖基乳糖回收率为95.97%~103.38%，乳糖-N-新四糖回收率为100.09%~104.01%。该方法能对婴配乳粉中的2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖同时测定，操作简单，具有良好的准确度和精密度，可为婴配乳粉质量监控方法提供参考。

关键词: 母乳低聚糖, 离子色谱, 2′-岩藻糖基乳糖, 乳糖-N-新四糖, 婴配乳粉

Abstract:

Simultaneous determination of 2'-fucosylactose and lacto-N-neotetraose in infant formula milk powder by ion chromatography is studied. These 2 human milk oligosaccharides （HMOs） are separated by ion chromatography， and determined by pulse amperometric detector， and quantified using an external standard method. The method is optimized through analyzing different purification methods， enzymatic hydrolysis treatment， different elution conditions， and the linear range. The effects of determining chromatographic conditions and pre-treatment conditions on separation are compared. The results show that the optimized method has a good linear relationship， with R²＞0.999. It also has good precision and accuracy， which the relative standard deviation （n=7） is ＜2.7%， and the recoveries of 2'-fucose lactose and lacto-N-neotetraose are 95.97%~103.38% and 100.09%~104.01%， respectively. This method can simultaneously determine 2'-fucose and lacto-N-neotetraose in infant formula milk powder. It is simple to operate， has good accuracy and precision， and can provide reference for the quality control method of infant formula milk powder.

Key words: Human milk oligosaccharides, Ion chromatography, 2'-Fucosylactose, Lactose-N-neotetraose, Infant milk powder

中图分类号:

O657.7

詹胜群, 葛城, 周荣杰, 周钧. 婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测[J]. 应用化学, 2024, 41(3): 405-414.

Sheng-Qun ZHAN, Cheng GE, Rong-Jie ZHOU, Jun ZHOU. Determination of 2′-Fucosylactose and Lacto-N-Neotetraose Contents in Infant Formula by High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detector[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2024, 41(3): 405-414.

图/表 10

表1 2种HMOs的梯度洗脱条件

Table 1 Gradient elution conditions of two HMOs

Time/min	Mobile phase A/%	Mobile phase B/%	Mobile phase C/%	Mobile phase D/%
0.000	20	0	0	80
2.000	20	0	0	80
30.000	35	0	0	65
35.000	35	0	0	65
35.100	0	0	100	0
40.000	0	0	100	0
40.100	0	100	0	0
45.000	0	100	0	0
45.100	20	0	0	80
50.000	20	0	0	80

图1 2种色谱柱对（A）2′-FL和（B）LNnT的分离效果图

Fig.1 The separation effect diagrams of two chromatographic columns for （A） 2′- FL and （B） LNnT

图2 添加（A）半乳糖苷酶和（B）果聚糖酶的影响

Fig.2 Effects of added （A） galactosidase and （B） fructosidase

图3 降低流动相中碱液的比例对LNnT分离的影响

Fig.3 Reducing the effect of the proportion of lye in the mobile phase on LNnT separation

图4 优化后2′-FL和LNnT的分离效果

Fig.4 Separation effect of 2′- FL and LNnT after optimization

图5 （A） 2′-FL和（B） LNnT线性范围设置对工作曲线的影响

Fig.5 The effect of setting the linear range of （A） 2'-FL and （B） LNnT on the working curve

图6 2′-FL和LNnT最终的线性范围以及线性方程

Fig.6 The final linear range of 2'-FL and LNnT and the linear equation

图7 GOS（A）和FOS（B）对2′-FL和LNnT的分离影响

Fig.7 Effect of GOS （A） and FOS （B） on the separation of 2'-FL and LNnT

表2 仪器精密度和方法精密度

Table 2 Instrument precision and method precision

		Apparatus precision（n=9）				Method precision（n=7）
		2'-FL		LNnT		2'-FL		LNnT
Items	Retention time/min	ρ/ （μg·mL^-1）	Peak area	Retention time/min	ρ/ （μg·mL^-1）	Peak area	Retention time/min	ρ/ （g·100 g^-1）	Retention time/min	ρ/ （g·100 g^-1）
Mean	17.867 1	3.893 3	12.198 9	29.444 8	1.973 5	3.802 9	17.758	1.145 5	29.473 0	0.252 2
SD	0.045 0	0.072 5	0.227 6	0.080 5	0.038 1	0.076 7	0.032	0.021 0	0.048	0.005 1
CV/%	0.25	1.86	1.87	0.27	1.93	2.02	0.18	1.83	0.16	2.03

表3 加标回收结果

Table 3 The result of spiked recovery

Mass/g	2'-FL			LNnT
Mass/g	Adding mass/mg	ρ/（μg·mL^-1）	Recovery/%	Adding mass/mg	ρ/（μg·mL^-1）	Recovery/%
2.019 5	23.990 4	7.912 3	98.94	12.047 3	4.068 6	101.32
2.042 1		8.227 0	102.88		4.118 8	102.57
2.005 5		8.267 4	103.38		4.147 3	103.28
2.003 7	15.993 6	5.313 3	99.66	8.031 5	2.734 4	102.14
2.045 9		5.409 7	101.47		2.784 4	104.01
2.000 5		5.296 4	99.35		2.723 1	101.72
2.040 5	7.996 8	2.558 3	95.97	4.015 8	1.347 2	100.64
2.009 1		2.633 4	98.79		1.376	102.79
2.008 5		2.558 7	95.99		1.339 8	100.09

参考文献 19

1	ZIVKOVIC A M， GERMAN J B， LEBRILLA C B， et al. Human milk glycobiome and its impact on the infant gastrointestinal microbiota［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108（1）： 4653-4658.
2	WICIŃSKI M， SAWICKA E， GĘBALSKI J， et al. Human milk oligosaccharides： health benefits， potential applications in infant formulas， and pharmacology［J］. Nutrients， 2020， 12（1）： 266.
3	KOLETZKO B， BRANDS B， GROTE V， et al. Early nutrition programming project. long-term health impact of early nutrition： the power of programming［J］. Ann Nutr Metab， 2017， 70： 161-169.
4	BLACK R E， ALLEN L H， BHUTTA Z A， et al. Maternal and child undernutrition study group. maternal and child undernutrition： global and regional exposures and health consequences［J］. Lancet， 2008， 371： 243-260.
5	DIETERICH C M， FELICE J P， O′SULLIVAN E， et al. Breastfeeding and health outcomes for the mother-infant dyad［J］. Pediatr Clin N Am， 2013， 60： 31-48.
6	CHRISTENSEN A S， SKOV S H， LENDAL S E， et al. Quantifying the human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose in different food applications by high performance liquid chromatography with refractive index detection［J］. J Food Sci， 2020， 85（2）： 332-339.
7	AUSTIN S， CUANY D， MICHAUD J， et al. Determination of 2'-fucosyllactose and lacto-n-neotetraose in infant formula［J］. Mol， 2018， 23（10）： 2650.
8	ELLINGSON D J， RUOSCH A J， FOSTER K L， et al. Analysis of six human milk oligosaccharides （HMO） in infant formula and adult nutritionals by 2AB labeling and quantification with HILIC-FLD： first action 2022.02［J］. J AOAC Int， 2022， 106（1）： 112-126.
9	AUSTIN S， DE CASTRO C A， BÉNET T， et al. Temporal change of the content of 10 oligosaccharides in the milk of Chinese urban mothers［J］. Nutrients， 2016， 8（6）： 346.
10	ZHANG W， WANG T， CHEN X， et al. Absolute quantification of twelve oligosaccharides in human milk using a targeted mass spectrometry-based approach［J］. Carbohydr Polym， 2019， 219： 328-333
11	FONG B， MA K， MCJARROW P. Quantification of bovine milk oligosaccharides using liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry［J］. J Agric Food Chem， 2011， 59（18）： 9788-9795.
12	BAO Y， CHEN C， NEWBURG D S. Quantification of neutral human milk oligosaccharides by graphitic carbon high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］. Anal Biochem， 2013， 433（1）： 28-35.
13	陈新新，芦晶，刘鹭，等. 超高效液相色谱-质谱法测定母乳中12种低聚糖［J］. 食品科学， 2018， 39（4）： 138-143.
	CHEN X X， LU J， LIU L， et al. Determination of 12 oligosaccharides in human milk by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Food Sci， 2018， 39（4）： 138-143.
14	MANK M， WELSCH P， HECK A J R， et al. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides （HMOs） and related human milk groups with enhanced structural selectivity［J］. Anal Bioanal Chem， 2019， 411（1）： 231-250.
15	NIJMAN R M， LIU Y， BUNYATRATCHATA A， et al. Characterization and quantification of oligosaccharides in human milk and infant formula［J］. J Agric Food Chem， 2018， 66（26）： 6851-6859.
16	陈磊， PHILIP H，田芳，等. 离子色谱法测定母乳中的寡聚糖与游离唾液酸［J］. 中国食品学报， 2019， 19（10）： 227-234.
	CHEN L， PHILIP H， TIAN F， et al. Determination of oligosaccharides and free sialic acid in human milk by ion chromatography［J］. J Chin Inst Food Sci Technol， 2019， 19（10）： 227-234.
17	GU F， KATE G A T， ARTS I C W， et al. Combining HPAEC-PAD， PGC-LC-MS， and 1D ¹H NMR to investigate metabolic fates of human milk oligosaccharides in 1-month-old infants： a pilot study［J］. J Agric Food Chem， 2021， 69（23）： 6495-6509.
18	AUER F， JARVAS G， GUTTMAN A. Recent advances in the analysis of human milk oligosaccharides by liquid phase separation methods［J］. J Chromatogr B， 2021， 1162： 122497.
19	尹大芳，孙晓杰，郭莹莹，等. 单糖定性定量的色谱分析方法的研究进展［J］. 食品工业科技， 2020， 41（24）： 321-329.
	YIN D F， SUN X J， GUO Y Y， et al. Development of qualitative and quantitative chromatographic analysis of monosaccharides［J］. Sci Technol Food Ind， 2020， 41（24）： 321-329.

[1]	杜米芳, 常国梁, 刘攀, 张毅, 张欣耀, 李景滨. 海绵钛中氯含量测定的离子色谱分析方法[J]. 应用化学, 2022, 39(9): 1412-1420.
[2]	张社利, 许文静, 范云场. 离子色谱法检测腐竹、粉丝中的乌洛托品[J]. 应用化学, 2014, 31(11): 1352-1355.
[3]	李祥平, 齐剑英, 陈永亨. 离子色谱法测定环境水体中的卤乙酸和草甘膦[J]. 应用化学, 2009, 26(4): 447-450.