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中华医学超声杂志
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线粒体靶向的近红外HClO/ClO －荧光探针的研究进展
黄蕊, 叶长青, 李亚军, 邱盟峯, 李达谅, 鲍红丽
应用化学    2022, 39 (3): 407-424.   DOI:10.19894/j.issn.1000-0518.210583
摘要   （618） HTML （18） PDF （4850KB）（1164）  

HClO/ClO-作为细胞质中一种重要的活性氧（ROS），源自线粒体，参与各种生理和病理过程，因此快速有效检测HClO/ClO-具有重要的生物学及生理学意义。荧光分析法因其灵敏度高、响应时间快、选择性高、成本低和操作简便等优点而备受关注。更重要的是，使用荧光探针可以在体外和体内可视化检测。近年来，为了研究HClO/ClO-在细胞中的作用，已发展了一些靶向线粒体的荧光HClO/ClO-探针。其中，发射波长位于短波区域的探针存在背景荧光强、组织穿透性差等不足，因此，开发具有远红外至近红外发射的HClO/ClO-探针具有重要意义。本文围绕用于检测HClO/ClO-的线粒体靶向近红外荧光探针的最新动态展开讨论，将探针检测HClO/ClO-的反应类型分为不饱和双键的氧化、硫醚的氧化、氨基或酰肼的氧化和多位点的氧化等几个类别进行了归纳总结，希望为新一代高效灵敏、生物兼容性好的靶向性HClO/ClO-荧光探针的发展提供一定的帮助。

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图2 探针羟基取代的香豆素-半菁和与ClO-的反应机制［ 54 ］
正文中引用本图/表的段落
但是，科研人员并不满足只在细胞中实现对HClO/ClO-的检测，随着生物成像技术的进一步发展，2020年，张彤课题组［54］合成了一种在香豆素-半菁骨架上吲哚鎓部分被羟基取代的探针，这种探针不仅有香豆素-半菁骨架优秀的水溶性和较大的斯托克斯位移，还对ClO-有很好的选择性［55-56］（图2），是首次探究在检测HClO的香豆素-半菁骨架上引入给电子基团对选择性和光学性能的影响。探针在650 nm处具有较高的荧光强度，当ClO-破坏了探针的大共轭结构时，立即观察到比色和比率的色谱实验现象，650 nm处的荧光消失，500 nm处出现新的荧光信号，探针对ClO-的检测限为49.1 nmol/L，在pH值5~8范围内表现良好，响应时间为2 min。探针可对RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中的内源性HClO进行成像和检测，在HepG2细胞（人肝癌细胞）中与线粒体绿色荧光探针进行了共定位实验，结果显示探针在线粒体中特异性染色，皮尔森系数为0.857。随后，利用羟基取代的香豆素-半菁探针开展了斑马鱼和关节炎的小鼠模型的荧光成像研究。仅带有探针的斑马鱼样本在红色通道显示出强烈的红色荧光，在加入ClO-或用脂多糖（LPS）诱导炎症产生内源性ClO－后，红色荧光减弱，蓝色荧光增强，实现了斑马鱼的内源性和外源性的ClO－的检测。此外，探针可在小鼠体内与外源性HClO快速反应，荧光强度与HClO的浓度呈线性关系（ R2=0.9393），通过注射 λ-卡拉胶和脂多糖引起关节炎的区域荧光减弱，未来有助于进一步诊断体内相关疾病。
但是，科研人员并不满足只在细胞中实现对HClO/ClO-的检测，随着生物成像技术的进一步发展，2020年，张彤课题组［ 54 ］合成了一种在香豆素-半菁骨架上吲哚鎓部分被羟基取代的探针，这种探针不仅有香豆素-半菁骨架优秀的水溶性和较大的斯托克斯位移，还对ClO-有很好的选择性［ 55 - 56 ］（ 图2 ），是首次探究在检测HClO的香豆素-半菁骨架上引入给电子基团对选择性和光学性能的影响.探针在650 nm处具有较高的荧光强度，当ClO-破坏了探针的大共轭结构时，立即观察到比色和比率的色谱实验现象，650 nm处的荧光消失，500 nm处出现新的荧光信号，探针对ClO-的检测限为49.1 nmol/L，在pH值5~8范围内表现良好，响应时间为2 min.探针可对RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中的内源性HClO进行成像和检测，在HepG2细胞（人肝癌细胞）中与线粒体绿色荧光探针进行了共定位实验，结果显示探针在线粒体中特异性染色，皮尔森系数为0.857.随后，利用羟基取代的香豆素-半菁探针开展了斑马鱼和关节炎的小鼠模型的荧光成像研究.仅带有探针的斑马鱼样本在红色通道显示出强烈的红色荧光，在加入ClO-或用脂多糖（LPS）诱导炎症产生内源性ClO－后，红色荧光减弱，蓝色荧光增强，实现了斑马鱼的内源性和外源性的ClO－的检测.此外，探针可在小鼠体内与外源性HClO快速反应，荧光强度与HClO的浓度呈线性关系（ R2=0.9393），通过注射 λ-卡拉胶和脂多糖引起关节炎的区域荧光减弱，未来有助于进一步诊断体内相关疾病. ...
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... 2016年，鲍光明课题组和曾林涛课题组报道了一种用于检测ClO－的NIR荧光探针 CMBI［ 51 ］，因为7-二乙氨基香豆素的紫外可见吸收光谱和发射光谱主要位于400~500 nm区域，不能穿透组织，受自身荧光背景的强烈干扰，所以科研人员通过引入苯并吲哚鎓盐达到延长共轭的目的，通过7-二乙氨基香豆素和苯并吲哚鎓基团之间的缩合构建探针 CMBI.由于 π-共轭面的延展和分子内电荷转移的作用，其最大发射波长可达到658 nm（ 图1 ）.在ClO-和 CMBI的光谱滴定实验中，基于碳碳双键的氧化裂解反应，在比色和比率上 CMBI显示出对ClO-具的双重响应，探针响应时间在90 s以内，最低检测限为33 nmol/L.当加入ClO-后， CMBI在658 nm处的荧光强度逐渐降低，475 nm处出现蓝移的荧光发射峰，加入10倍化学计量的ClO-后，比率值（ F 475/ F 658）增强了370倍.此外，苯并吲哚鎓盐可以增加水溶性，帮助探针选择性地在活细胞的线粒体中积累［ 52 - 53 ］，在HeLa细胞（人宫颈癌细胞）上的荧光共聚焦实验表明， CMBI与线粒体绿色荧光探针的叠加效果很好，皮尔森系数为0.94，可以实现在活细胞线粒体上对ClO-的实时监测. ...
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... 2016年，鲍光明课题组和曾林涛课题组报道了一种用于检测ClO－的NIR荧光探针 CMBI［ 51 ］，因为7-二乙氨基香豆素的紫外可见吸收光谱和发射光谱主要位于400~500 nm区域，不能穿透组织，受自身荧光背景的强烈干扰，所以科研人员通过引入苯并吲哚鎓盐达到延长共轭的目的，通过7-二乙氨基香豆素和苯并吲哚鎓基团之间的缩合构建探针 CMBI.由于 π-共轭面的延展和分子内电荷转移的作用，其最大发射波长可达到658 nm（ 图1 ）.在ClO-和 CMBI的光谱滴定实验中，基于碳碳双键的氧化裂解反应，在比色和比率上 CMBI显示出对ClO-具的双重响应，探针响应时间在90 s以内，最低检测限为33 nmol/L.当加入ClO-后， CMBI在658 nm处的荧光强度逐渐降低，475 nm处出现蓝移的荧光发射峰，加入10倍化学计量的ClO-后，比率值（ F 475/ F 658）增强了370倍.此外，苯并吲哚鎓盐可以增加水溶性，帮助探针选择性地在活细胞的线粒体中积累［ 52 - 53 ］，在HeLa细胞（人宫颈癌细胞）上的荧光共聚焦实验表明， CMBI与线粒体绿色荧光探针的叠加效果很好，皮尔森系数为0.94，可以实现在活细胞线粒体上对ClO-的实时监测. ...
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... 但是，科研人员并不满足只在细胞中实现对HClO/ClO-的检测，随着生物成像技术的进一步发展，2020年，张彤课题组［ 54 ］合成了一种在香豆素-半菁骨架上吲哚鎓部分被羟基取代的探针，这种探针不仅有香豆素-半菁骨架优秀的水溶性和较大的斯托克斯位移，还对ClO-有很好的选择性［ 55 - 56 ］（ 图2 ），是首次探究在检测HClO的香豆素-半菁骨架上引入给电子基团对选择性和光学性能的影响.探针在650 nm处具有较高的荧光强度，当ClO-破坏了探针的大共轭结构时，立即观察到比色和比率的色谱实验现象，650 nm处的荧光消失，500 nm处出现新的荧光信号，探针对ClO-的检测限为49.1 nmol/L，在pH值5~8范围内表现良好，响应时间为2 min.探针可对RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中的内源性HClO进行成像和检测，在HepG2细胞（人肝癌细胞）中与线粒体绿色荧光探针进行了共定位实验，结果显示探针在线粒体中特异性染色，皮尔森系数为0.857.随后，利用羟基取代的香豆素-半菁探针开展了斑马鱼和关节炎的小鼠模型的荧光成像研究.仅带有探针的斑马鱼样本在红色通道显示出强烈的红色荧光，在加入ClO-或用脂多糖（LPS）诱导炎症产生内源性ClO－后，红色荧光减弱，蓝色荧光增强，实现了斑马鱼的内源性和外源性的ClO－的检测.此外，探针可在小鼠体内与外源性HClO快速反应，荧光强度与HClO的浓度呈线性关系（ R2=0.9393），通过注射 λ-卡拉胶和脂多糖引起关节炎的区域荧光减弱，未来有助于进一步诊断体内相关疾病. ...

2019年，殷彩霞课题组对检测内源性或外源性HClO/ClO-比率型荧光探针展开了探究.为进一步实现线粒体内的HClO可视化检测［ 57 - 58 ］.2020年，阴彩霞课题组基于激发态分子内质子转移（ESIPT）的反应机制，设计合成了一种线粒体靶向的近红外“双模式”荧光探针 NSSN［ 59 ］.通过对酚羟基邻位的醛基和2-甲基苯并噻唑鎓盐构建碳碳双键，进一步延长共轭，从而使探针荧光发射向近红外区移动，在670 nm（ Φ=0.047）处显示出最强荧光发射（ 图3 ）.由于HClO的氧化性质，随着HClO（0~30 μmol/L）的加入，探针的碳碳双键被破坏，导致荧光光谱发生变化，670 nm处的发射峰逐渐减小，540 nm处的发射峰逐渐增大（ 图4 ）. NSSN探针具有良好的选择性、较大的斯托克斯位移（220 nm）和低的检测限（0.13 μmol/L），可以作为比率型近红外荧光探针检测低浓度HClO.在HClO浓度达到30 μmol/L以上时，540 nm处的发射峰出现红移，并在552 nm处逐渐增加（ Φ=0.049），这实现了对高浓度HClO的“turn-on”式检测.当HClO浓度为120 μmol/L时，荧光强度逐渐增强，可在5 min内达到平稳.此外， NSSN作为一种近红外荧光探针，具有大斯托克斯位移、低信噪比和更深的组织穿透能力，可以在HeLa细胞中实现HClO的线粒体靶向检测，也可以在裸鼠中可视化检测HClO，有望被用于慢性肝病的早期诊断.2021年，殷彩霞课题组［ 60 ］同样利用苯并噻唑化合物的ESIPT反应机制来扩展共轭体系，设计出具有大斯托克斯位移的比色型荧光探针来检测HClO，有助于了解HClO在氧化应激中的生理功能及其免疫作用.同年，殷彩霞课题组［ 61 ］进一步发展了线粒体靶向荧光探针，具有超快响应（5 s）和高选择性，成功应用于斑马鱼和裸鼠中的HClO可视化检测. ...
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... 但是，科研人员并不满足只在细胞中实现对HClO/ClO-的检测，随着生物成像技术的进一步发展，2020年，张彤课题组［ 54 ］合成了一种在香豆素-半菁骨架上吲哚鎓部分被羟基取代的探针，这种探针不仅有香豆素-半菁骨架优秀的水溶性和较大的斯托克斯位移，还对ClO-有很好的选择性［ 55 - 56 ］（ 图2 ），是首次探究在检测HClO的香豆素-半菁骨架上引入给电子基团对选择性和光学性能的影响.探针在650 nm处具有较高的荧光强度，当ClO-破坏了探针的大共轭结构时，立即观察到比色和比率的色谱实验现象，650 nm处的荧光消失，500 nm处出现新的荧光信号，探针对ClO-的检测限为49.1 nmol/L，在pH值5~8范围内表现良好，响应时间为2 min.探针可对RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中的内源性HClO进行成像和检测，在HepG2细胞（人肝癌细胞）中与线粒体绿色荧光探针进行了共定位实验，结果显示探针在线粒体中特异性染色，皮尔森系数为0.857.随后，利用羟基取代的香豆素-半菁探针开展了斑马鱼和关节炎的小鼠模型的荧光成像研究.仅带有探针的斑马鱼样本在红色通道显示出强烈的红色荧光，在加入ClO-或用脂多糖（LPS）诱导炎症产生内源性ClO－后，红色荧光减弱，蓝色荧光增强，实现了斑马鱼的内源性和外源性的ClO－的检测.此外，探针可在小鼠体内与外源性HClO快速反应，荧光强度与HClO的浓度呈线性关系（ R2=0.9393），通过注射 λ-卡拉胶和脂多糖引起关节炎的区域荧光减弱，未来有助于进一步诊断体内相关疾病. ...
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... 但是，科研人员并不满足只在细胞中实现对HClO/ClO-的检测，随着生物成像技术的进一步发展，2020年，张彤课题组［ 54 ］合成了一种在香豆素-半菁骨架上吲哚鎓部分被羟基取代的探针，这种探针不仅有香豆素-半菁骨架优秀的水溶性和较大的斯托克斯位移，还对ClO-有很好的选择性［ 55 - 56 ］（ 图2 ），是首次探究在检测HClO的香豆素-半菁骨架上引入给电子基团对选择性和光学性能的影响.探针在650 nm处具有较高的荧光强度，当ClO-破坏了探针的大共轭结构时，立即观察到比色和比率的色谱实验现象，650 nm处的荧光消失，500 nm处出现新的荧光信号，探针对ClO-的检测限为49.1 nmol/L，在pH值5~8范围内表现良好，响应时间为2 min.探针可对RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中的内源性HClO进行成像和检测，在HepG2细胞（人肝癌细胞）中与线粒体绿色荧光探针进行了共定位实验，结果显示探针在线粒体中特异性染色，皮尔森系数为0.857.随后，利用羟基取代的香豆素-半菁探针开展了斑马鱼和关节炎的小鼠模型的荧光成像研究.仅带有探针的斑马鱼样本在红色通道显示出强烈的红色荧光，在加入ClO-或用脂多糖（LPS）诱导炎症产生内源性ClO－后，红色荧光减弱，蓝色荧光增强，实现了斑马鱼的内源性和外源性的ClO－的检测.此外，探针可在小鼠体内与外源性HClO快速反应，荧光强度与HClO的浓度呈线性关系（ R2=0.9393），通过注射 λ-卡拉胶和脂多糖引起关节炎的区域荧光减弱，未来有助于进一步诊断体内相关疾病. ...
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