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线粒体靶向的近红外HClO/ClO ^－荧光探针的研究进展

黄蕊, 叶长青, 李亚军, 邱盟峯, 李达谅, 鲍红丽

应用化学 2022, 39 (3): 407-424. DOI:10.19894/j.issn.1000-0518.210583

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HClO/ClO^-作为细胞质中一种重要的活性氧（ROS），源自线粒体，参与各种生理和病理过程，因此快速有效检测HClO/ClO^-具有重要的生物学及生理学意义。荧光分析法因其灵敏度高、响应时间快、选择性高、成本低和操作简便等优点而备受关注。更重要的是，使用荧光探针可以在体外和体内可视化检测。近年来，为了研究HClO/ClO^-在细胞中的作用，已发展了一些靶向线粒体的荧光HClO/ClO^-探针。其中，发射波长位于短波区域的探针存在背景荧光强、组织穿透性差等不足，因此，开发具有远红外至近红外发射的HClO/ClO^-探针具有重要意义。本文围绕用于检测HClO/ClO^-的线粒体靶向近红外荧光探针的最新动态展开讨论，将探针检测HClO/ClO^-的反应类型分为不饱和双键的氧化、硫醚的氧化、氨基或酰肼的氧化和多位点的氧化等几个类别进行了归纳总结，希望为新一代高效灵敏、生物兼容性好的靶向性HClO/ClO^-荧光探针的发展提供一定的帮助。

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图15 荧光探针Cy7?Nil对不同浓度HClO/ClO^-的荧光响应过程^{［

86
］}

正文中引用本图/表的段落

2020年，易涛课题组设计合成了一种包含2个近红外发色团的荧光探针 Cy7?Nil［86］，尼罗红作为稳定的发色团具有大的刚性平面结构、大的 π共轭骨架以及双光子激发近红外发射活性（图15）［87-90］。 Cy7则作为HClO/ClO-的识别部分，具有良好的光物理特性，即更长的近红外发射波长、高摩尔吸收效率和荧光量子产率［91-94］。该探针具有3个发射信号（560、650和780 nm），是首个实现了双通道（ I ₆₅₀/ I ₅₆₀和 I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和活体动物内对HClO/ClO－的比率检测。在PBS缓冲溶液中加入HClO/ClO-，探针的Cy7共轭结构被破坏，并且随着HClO/ClO－浓度的变化可观察到不同波长的荧光强度变化。当HClO/ClO-浓度小于20 μmol/L时，3个发射信号的荧光强度均有不同程度的减弱，780 nm处的荧光被猝灭98.5%；当HClO/ClO-浓度大于20 μmol/L时，560 nm处的荧光强度大幅减弱，同时650 nm产生大约10倍的荧光增强，因此荧光强度的比率变化被用于实现HClO/ClO－浓度的精确定量。当使用100 μmol/L HClO/ClO－时，根据（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）的比率荧光变化，可观察到最大约120倍的增强。此外，共定位实验表明，探针 Cy7?Nil主要位于线粒体中，可检测HeLa细胞中的外源性HClO/ClO-和RAW264.7细胞中的内源性HClO/ClO-。探针 Cy7?Nil还能进一步在组织和体内成像中表现出更好的性能，在小鼠肝组织切片中最大穿透深度约为400 μm，并且可通过近红外发射信号（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和近红外比率检测方式（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）实现小鼠后肢关节炎模型上内源性HClO/ClO-的检测。同年，易涛课题组［95］设计合成了一种可激活的探针，通过双模态成像检测HClO，首次发现了药物诱导急性肾损伤（AKI）细胞凋亡过程中的HClO的存在，在肾损伤疾病的监测和临床研究的药物筛选方面有巨大的潜力。

2020年，易涛课题组设计合成了一种包含2个近红外发色团的荧光探针 Cy7?Nil［ 86 ］，尼罗红作为稳定的发色团具有大的刚性平面结构、大的 π共轭骨架以及双光子激发近红外发射活性（图15 ）［ 87 - 90 ］. Cy7则作为HClO/ClO-的识别部分，具有良好的光物理特性，即更长的近红外发射波长、高摩尔吸收效率和荧光量子产率［ 91 - 94 ］.该探针具有3个发射信号（560、650和780 nm），是首个实现了双通道（ I ₆₅₀/ I ₅₆₀和 I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和活体动物内对HClO/ClO－的比率检测.在PBS缓冲溶液中加入HClO/ClO-，探针的Cy7共轭结构被破坏，并且随着HClO/ClO－浓度的变化可观察到不同波长的荧光强度变化.当HClO/ClO-浓度小于20 μmol/L时，3个发射信号的荧光强度均有不同程度的减弱，780 nm处的荧光被猝灭98.5%；当HClO/ClO-浓度大于20 μmol/L时，560 nm处的荧光强度大幅减弱，同时650 nm产生大约10倍的荧光增强，因此荧光强度的比率变化被用于实现HClO/ClO－浓度的精确定量.当使用100 μmol/L HClO/ClO－时，根据（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）的比率荧光变化，可观察到最大约120倍的增强.此外，共定位实验表明，探针 Cy7?Nil主要位于线粒体中，可检测HeLa细胞中的外源性HClO/ClO-和RAW264.7细胞中的内源性HClO/ClO-.探针 Cy7?Nil还能进一步在组织和体内成像中表现出更好的性能，在小鼠肝组织切片中最大穿透深度约为400 μm，并且可通过近红外发射信号（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和近红外比率检测方式（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）实现小鼠后肢关节炎模型上内源性HClO/ClO-的检测.同年，易涛课题组［ 95 ］设计合成了一种可激活的探针，通过双模态成像检测HClO，首次发现了药物诱导急性肾损伤（AKI）细胞凋亡过程中的HClO的存在，在肾损伤疾病的监测和临床研究的药物筛选方面有巨大的潜力. ...

... 2019年，张贵生课题组和毛国江课题组［ 84 ］设计了以三苯基膦鎓盐阳离子作为线粒体靶向识别基团的双光子探针 Mito?TP?ClO，其中二苯甲酰肼作为ClO-的反应位点（图14 ）.当在PBS缓冲溶液中加入NaClO，探针在605 nm处的紫外吸收强度和在650 nm处的荧光发射强度逐渐增强.中性或碱性条件下，探针能有效监测NaClO.用市售的线粒体绿色荧光探针与双光子探针 Mito?TP?ClO在HeLa细胞中的进行共定位实验证明，探针具有线粒体靶向性，皮尔森系数为0.94.在LPS和PMA的刺激下，探针 Mito?TP?ClO以双光子模式检测RAW264.7细胞中内源性ClO-，并且有优异的光稳定性，满足ClO-长时间生物成像应用的需要.探针 Mito?TP?ClO可用于监测组织中的ClO-，在共聚焦成像深度为230 μm的 Z轴层切扫描模式下，可以收集不同深度组织切片的荧光信号.此外，探针 Mito?TP?ClO可用于监测在细菌感染的RAW264.7细胞和炎症小鼠模型中ClO-的荧光成像：感染大肠杆菌的RAW264.7细胞发出强烈的荧光，而未感染的细胞没有明显荧光，这说明荧光增强确实是由细菌感染后的ClO-引起的；被LPS/PMA处理过的小鼠模型比未处理的小鼠模型表现出更强的荧光信号，这说明探针能够检测活体动物内源性ClO-，可用于检测各种疾病引起的炎症.2021年，张贵生课题组和毛国江课题组［ 85 ］设计与合成了溶酶体靶向的双光子近红外荧光探针，可用于检测溶酶体中的HClO、诊断小鼠的早期关节炎和监测关节炎治疗过程，是一种有用的化学工具. ...

... 2020年，易涛课题组设计合成了一种包含2个近红外发色团的荧光探针 Cy7?Nil［ 86 ］，尼罗红作为稳定的发色团具有大的刚性平面结构、大的 π共轭骨架以及双光子激发近红外发射活性（图15 ）［ 87 - 90 ］. Cy7则作为HClO/ClO-的识别部分，具有良好的光物理特性，即更长的近红外发射波长、高摩尔吸收效率和荧光量子产率［ 91 - 94 ］.该探针具有3个发射信号（560、650和780 nm），是首个实现了双通道（ I ₆₅₀/ I ₅₆₀和 I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和活体动物内对HClO/ClO－的比率检测.在PBS缓冲溶液中加入HClO/ClO-，探针的Cy7共轭结构被破坏，并且随着HClO/ClO－浓度的变化可观察到不同波长的荧光强度变化.当HClO/ClO-浓度小于20 μmol/L时，3个发射信号的荧光强度均有不同程度的减弱，780 nm处的荧光被猝灭98.5%；当HClO/ClO-浓度大于20 μmol/L时，560 nm处的荧光强度大幅减弱，同时650 nm产生大约10倍的荧光增强，因此荧光强度的比率变化被用于实现HClO/ClO－浓度的精确定量.当使用100 μmol/L HClO/ClO－时，根据（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）的比率荧光变化，可观察到最大约120倍的增强.此外，共定位实验表明，探针 Cy7?Nil主要位于线粒体中，可检测HeLa细胞中的外源性HClO/ClO-和RAW264.7细胞中的内源性HClO/ClO-.探针 Cy7?Nil还能进一步在组织和体内成像中表现出更好的性能，在小鼠肝组织切片中最大穿透深度约为400 μm，并且可通过近红外发射信号（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）和近红外比率检测方式（ I ₆₅₀/ I ₇₈₀）实现小鼠后肢关节炎模型上内源性HClO/ClO-的检测.同年，易涛课题组［ 95 ］设计合成了一种可激活的探针，通过双模态成像检测HClO，首次发现了药物诱导急性肾损伤（AKI）细胞凋亡过程中的HClO的存在，在肾损伤疾病的监测和临床研究的药物筛选方面有巨大的潜力. ...

2021年，林伟英课题组［ 96 ］设计了一种基于聚硅氧烷的新型线粒体靶向可逆荧光探针 P?HClO?SO₂，分别用于检测细胞内和体内SO ₂以及HClO之间的氧化还原过程.通过聚巯基丙基硅氧烷（PMMS）和Cy-7-Cl之间的SN ₂取代反应简单合成，产率为62%（图16 ）.探针在670 nm处显示出稳定的发射波长，当硫醚和碳碳双键被氧化后，电子重新排列，氧化过程破坏了先前的共轭结构，因此与HClO反应后荧光减弱（图17 ）.利用SO ₂清除体内相关活性氧的能力，抵消了HClO引起的氧化应激，通过可逆反应研究了探针对SO ₂的可逆能力，当NaHSO ₃处理后，荧光强度随处理时间的延长而显著增强，探针的荧光可以在120 s内恢复，对SO ₂具有很高的灵敏度.探针分别在HeLa细胞，4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）和Raw 264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中进行了毒性测试，30 μmol/L的探针 P?HClO?SO₂，对多种细胞无明显的细胞毒性，细胞存活率接近90%.在HeLa细胞中的共定位实验显示探针具有线粒体靶向性，重叠系数为0.96.在HeLa细胞中的内源性实验证明了探针 P?HClO?SO₂ 在细胞环境中对SO ₂/HClO氧化还原循环过程的响应，探针表现出高度的敏感性.探针 P?HClO?SO₂ 还可以进一步高灵敏地检测斑马鱼和小鼠体内的氧化还原过程，有助于将应用扩展到生物领域，设计出更多检测氧化还原循环的近红外荧光探针. ...

... 2021年，林伟英课题组［ 96 ］设计了一种基于聚硅氧烷的新型线粒体靶向可逆荧光探针 P?HClO?SO₂，分别用于检测细胞内和体内SO ₂以及HClO之间的氧化还原过程.通过聚巯基丙基硅氧烷（PMMS）和Cy-7-Cl之间的SN ₂取代反应简单合成，产率为62%（图16 ）.探针在670 nm处显示出稳定的发射波长，当硫醚和碳碳双键被氧化后，电子重新排列，氧化过程破坏了先前的共轭结构，因此与HClO反应后荧光减弱（图17 ）.利用SO ₂清除体内相关活性氧的能力，抵消了HClO引起的氧化应激，通过可逆反应研究了探针对SO ₂的可逆能力，当NaHSO ₃处理后，荧光强度随处理时间的延长而显著增强，探针的荧光可以在120 s内恢复，对SO ₂具有很高的灵敏度.探针分别在HeLa细胞，4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）和Raw 264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中进行了毒性测试，30 μmol/L的探针 P?HClO?SO₂，对多种细胞无明显的细胞毒性，细胞存活率接近90%.在HeLa细胞中的共定位实验显示探针具有线粒体靶向性，重叠系数为0.96.在HeLa细胞中的内源性实验证明了探针 P?HClO?SO₂ 在细胞环境中对SO ₂/HClO氧化还原循环过程的响应，探针表现出高度的敏感性.探针 P?HClO?SO₂ 还可以进一步高灵敏地检测斑马鱼和小鼠体内的氧化还原过程，有助于将应用扩展到生物领域，设计出更多检测氧化还原循环的近红外荧光探针. ...

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