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基于温敏性 N， N-二甲基丙烯酰胺/ N-异丙基丙烯酰胺无规共聚物的毛细管无胶电泳筛分介质

江凤浩, 洪瀚, 姜伯玮, 苏朝晖

应用化学 2023, 40 (9): 1312-1321. DOI:10.19894/j.issn.1000-0518.230125

摘要（219）

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本文合成了N，N-二甲基丙烯酰胺/N-异丙基丙烯酰胺无规共聚物（P（DMA-co-NIPAM））和聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA），并将二者共混制备毛细管无胶电泳筛分介质，旨在降低筛分介质粘度的同时增强其对DNA的分离性能。核磁共振氢谱（¹H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证明了2种聚合物的成功合成。表征了P（DMA-co-NIPAM）/PDMA共混物溶液的流体力学直径（D_h）、低剪切粘度和吸光度，结果表明，P（DMA-co-NIPAM）聚合物具有温敏性，低临界溶解温度（LCST）为60~80 ℃。DNA筛分结果显示，PDMA中添加了10% P（DMA-co-NIPAM）的复合筛分介质性能最好，相比PDMA粘度降低19%以上，对大DNA片段的分辨率和理论塔板数均明显提高，分离时间缩短4%，显示了优良的分离性能。

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图6 复合筛分介质分离标准DNA样品的（A）分辨率、（B）理论塔板数和（C）电泳完成时间及其（D）迁移时间与对应核苷酸数目的线性拟合曲线，工作温度为60 ℃

正文中引用本图/表的段落

图6总结了分析P（DMA- co-NIPAM）/PDMA复合介质筛分标准DNA样品的电泳分离谱图得到的数据。图6A和6B是各复合筛分介质对（99/100） bp、（243/244） bp和（414/420） bp 3组DNA片段的分辨率以及理论塔板数。由图6A可知，与PDMA筛分介质样品相比，筛分介质Ⅰ对（414/420） bp的分辨率由3.34提升到3.57，分辨率提升7%，对（99/100） bp和（243/244） bp的分辨率没有明显差别。当 m（P（DMA- co-NIPAM））∶ m（PDMA）比例继续增大到2∶8，筛分介质Ⅱ对3种片段的分辨率基本与PDMA筛分介质相当。筛分介质Ⅲ数据结果显示，所有尺寸DNA分辨率均比PDMA筛分介质差，（243/244） bp的分辨率为0.14，无法被有效分离。分辨率先增加是由于P（DMA- co-NIPAM）对高分子缠结的加强作用，而后减弱则是因为P（DMA- co-NIPAM）的分子链较短，聚合物所形成的网络结构对大尺寸的DNA分子的阻碍作用减弱，缠结点在DNA分子的挤压下被破坏。

图6B结果显示，含有P（DMA- co-NIPAM）的筛分介质对各DNA片段的理论塔板数比纯PDMA的筛分介质更高（样品Ⅲ对100 bp除外）。与纯PDMA相比，筛分介质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对于长度为420、244和100 bp片段分离的理论塔板数分别提高了21%~26%、18%~33%和10%~26%。由公式（2）知，理论塔板数与出峰时间和半峰宽2个因素有关。出峰时间越晚，或者半峰宽越小，则理论塔板数（分离效率）越大。由图6C可以观察到，P（DMA- co-NIPAM）质量分数越高，电泳时间越短。PDMA筛分介质分离完成时间为22.4 min，复合筛分介质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ则分别为21.5、21.3和17.8 min，复合筛分介质Ⅰ的分离时间比PDMA下降了4%。电泳完成时间越短，理论塔板数本该下降。然而，由于含有P（DMA- co-NIPAM）的复合筛分介质DNA电泳出峰的半峰宽更窄，峰型更加尖锐，使得理论塔板数增大。这证明了P（DMA- co-NIPAM）的加入使得DNA分子迁移速率均一性提高，同尺寸DNA出峰时间更为集中。这可能是因为无规共聚物的收缩改善了高分子交缠网络的孔径均匀性，使相同尺寸大小的DNA片段迁移过程中受到的阻碍作用更加一致。

不同尺寸的DNA片段在毛细管内迁移时，出峰时间与DNA的核苷酸数目呈正相关，核苷酸越多，迁移时间越长。然而，迁移时间与核苷酸数目并非是严格的线性关系，存在一定程度的偏移。DNA相对分子质量增大到一定程度，高分子筛分网络对其分离能力减弱，DNA出峰时间间隔就会变短。然而良好的线性关系有助于对DNA样品进行精确的分析，因此实际应用中希望筛分介质对DNA片段的迁移时间与核苷酸数目之间具有较好的线性关系。图6D是几种介质筛分DNA样品的迁移时间与核苷酸数目之间的关系，其线性拟合的相关系数列于表2。从图6D和表2可以看出，纯PDMA筛分介质与复合筛分介质Ⅰ、Ⅱ均具有良好的线性关系；随着P（DMA- co-NIPAM）的比例增大，筛分介质对DNA片段的迁移时间与核苷酸数目的关系逐渐偏离线性，筛分介质III的偏移较为严重，已不适宜用来分离大尺寸DNA样品。

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