低温β-甘露聚糖酶的酶学性质及破胶性能

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220139

摘要/Abstract

摘要：

页岩油气藏开发过程中返排液的破胶及低温油藏压裂液的破胶是目前页岩油气藏及致密油气藏开发过程中面临的一个难题。由于化学破胶剂使用时需要较高的温度，难以满足低温条件下彻底破胶的要求。为此，针对低温酶破胶剂，采用高通量筛选方法，从油田压裂返排水和魔芋地的混合样品中筛选出高效低温β-甘露聚糖酶产生菌，并对所产低温β-甘露聚糖酶的酶学性质及破胶性能进行了研究。结果表明，在筛选到的40个产酶菌株中，菌株O5鉴定为施氏假单胞菌，其产生β-甘露聚糖酶（ME-O5）的最适温度为50 ℃，在5~20 ℃时酶活力仍能保持约60%以上，低温活性突出，在中温区域的热稳定性良好；最适pH=7.0，具有一定的pH适应性和较宽的pH耐受范围。ME-O5在5和20 ℃下均能将瓜尔胶溶液的粘度降低至5 mPa·s以下，降粘率>99%，降粘效果显著。在10、20和50 ℃下，压裂液经ME-O5破胶处理3 h后，破胶液的表观粘度<5 mPa·s，表面张力<28 mN/m，界面张力<2 mN/m，残渣量<600 mg/L，均达到或优于我国石油天然气行业标准SY/T 6376-2008的要求，在油田压裂低温破胶方面具有良好的应用前景。

关键词: β-甘露聚糖酶, 低温活性, 酶学性质, 破胶性能, 低温酶破胶剂

Abstract:

The gel breaking of flowback fluid and low temperature oil fracturing fluid is a difficult problem currently faced in the development of shale and tight oil and gas reservoirs. Due to the high temperature required for the use of chemical gel breaker， it is difficult to meet the requirements of completely gel breaking under low temperature conditions. To this end， a high-throughput screening methodis used to screen out high-efficiency low-temperature β-mannanase-producing bacteriafrom the mixed samples of oilfield fracturing flowback fluid and konjac land. The enzymatic properties and gel-breaking performance of this low-temperature β-mannanase are studied. The results show that， among the 40 screened strains， strain O5 is identified as Pseudomonasstutzeri. The optimum temperature for β-mannanase ME-O5 （ME-O5） is 50 ℃， and its enzyme activity could still maintain more than 60% at 5~20 ℃. The low temperature activity is outstanding， and the thermal stability is good in the middle temperature region. The optimum pH for ME-O5 is 7.0， with a certain pH adaptability and a wide pH tolerance range. At both 5 and 20 ℃， ME-O5 reduces the viscosity of guar gum to less than 5 mPa·s， the viscosity reduction rate is more than 99%， and the effect of viscosity reduction is remarkable. At 10， 20 and 50 ℃， after the fracturing fluid is treated by gel breaking for 3 h with ME-O5， the apparent viscosity of the gel breaking fluid is less than 5 mPa·s， the surface tension is less than 28 mN/m， the interfacial tension is less than 2 mN/m， and the amount of residue is less than 600 mg/L. The results meet or exceed the requirements of Oil and Gas Industry Standard SY/T 6376-2008. It shows a good application prospect inlow temperature gel breaking of oil field fracturing.

Key words: β-Mannanase, Low temperature activity, Enzymatic properties, Gel breaking performance, Low-temperature enzyme gel breaker

中图分类号:

O629.8

熊玉华, 周蕾, 杨世忠, 牟伯中. 低温β-甘露聚糖酶的酶学性质及破胶性能[J]. 应用化学, 2023, 40(1): 134-145.

Yu-Hua XIONG, Lei ZHOU, Shi-Zhong YANG, Bo-Zhong MU. Enzymatic Properties and Gel Breaking Performance of Low-temperature β-Mannanase[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2023, 40(1): 134-145.

图/表 10

表1 已分离的40株菌所产β-甘露聚糖酶的酶活力

Table 1 β-Mannanase activity of 40 isolated strains

Strain	Enzyme activity/（U·mL^-1）	Strain	Enzyme activity/（U·mL^-1）	Strain	Enzyme activity/（U·mL^-1）
A1	101.1	H25	136.1	O36	99.9
A2	143.2	J24	77.8	Q1	111.7
A5	90.8	J33	100.2	Q3	118.6
A6	100.3	K20	108.3	Q4	126.7
A8	79.1	K33	117.4	Q10	123.1
A9	89.3	L10	157.1	Q12	92.2
H1	96.7	L11	89.6	Q14	119.0
H6	82.3	O3	92.1	S4	116.1
H9	90.2	O5	208.9	S11	90.3
H11	99.8	O11	88.8	X1	113.3
H12	115.1	O12	80.2	X36	125.2
H13	122.7	O27	68.8	X44	136.9
H22	59.7	O32	136.2	X64	122.8
H24	98.0

图1 不同时间下瓜尔胶溶液的粘度A.20 ℃； B.5 ℃

Fig.1 Viscosity of guar gum solution at different time

图2 菌株O5的刚果红染色（A）及降解瓜尔胶特性（B）

Fig.2 Congo red staining （A） and guar gum degradation characteristics （B） of strain O5

图3 菌株O5的形态学观察A. colony morphology； B. SEM image of O5

Fig.3 Morphological characteristics of strain O5

图4 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

Fig.4 The phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence

图5 温度、pH值对β-甘露聚糖酶酶活力及稳定性的影响A. Effect of temperature on the β-mannanase activity； B. Effect of temperature on the β-mannanase stability； C.Effect of pH on the β-mannanase activity； D. Effect of pH on the β-mannanase stability

Fig.5 Effects of temperature and pH on the enzymatic activity and stability of β-mannanase

图6 5、20 ℃时瓜尔胶溶液的粘度变化

Fig.6 Viscosity change of guar gum solution at 5 ℃ and 20 ℃

表2 ME-O5与不同压裂液添加剂的配伍性

Table 2 Compatibility of the ME-O5 with different fracturing fluid additives

Additives	Viscosity of gel breaking solution after 3 h/（mPa·s）
KCl	2.64
Na₂CO₃	4.80
NaHCO₃	2.07
Glutaraldehyde	3.85
Borax	3.09
Guar gum blank	1.92

图7 不同温度下压裂液粘度随时间的变化

Fig.7 Variation of fracturing fluid viscosity with time at different temperatures

表3 破胶液的评价

Table 3 Evaluation of gel-breaking fluid

Temperature/℃	Surface tension/（mN·m^-1）	Interfacial tension/（mN·m^-1）	Residue content/（mg·L^-1）
10	22.86	0.94	438.00
20	22.41	0.77	379.00
50	21.15	0.73	414.00

参考文献 41

1	TANG J， LI H， YAN S， et al. In situ synthesis， structure， and properties of a dendritic branched nano-thickening agent for high temperature fracturing fluid ［J］. J Appl Polym Sci， 2020， 137（5）： 48446.
2	夏熙，杨二龙. 页岩气压裂液研究进展及展望［J］. 化学工程师， 2019， 33（7）： 59-63.
	XIA X， YANG E L. Research progress and prospect of shale gas fracturing fluid［J］. Chem Eng， 2019， 33（7）： 59-63.
3	黄飞飞，蒲春生，陆雷超，等. 胍胶压裂液高效破胶降解剂体系研究［J］. 应用化工， 2021， 50（5）： 1168-1172.
	HUANG F F， PU C S， LU L C， et al. Complex agent system used for the effectively breaking and degrading of the guar gum fracturing fluid［J］. Appl Chem Ind， 2021， 50（5）： 1168-1172.
4	尤佳，刘金峰，杨世忠，等. MEMA10耐低温复合酶活性与破胶性能［J］. 油田化学， 2016， 33（4）： 612-618.
	YOU J， LIU J F， YANG S Z， et al. Activity and gel breaking performance of a low-temperature-tolerant complex enzyme MEMA10［J］. Oilfield Chem， 2016， 33（4）： 612-618.
5	安毅，田哲熙，刘灏亮，等. 过硫化物对压裂液破胶性能的实验研究［J］. 化学工程师， 2017， 31（7）： 15-18.
	AN Y， TIAN Z X， LIU H L，et al. Experimental study on the fracture performance of the fracturing fluid by the over sulfide［J］. Chem Eng， 2017， 31（7）： 15-18.
6	OZKAN E， RAGHAVAN R. A computationally efficient， transient-pressure solution for inclined wells［J］. SPE Reserv Eval Eng， 2000， 3（5）： 414-425.
7	贺晓军，李君，李宁涛，等. 过硫酸铵与生物酶压裂破胶技术对比研究［J］. 石油化工应用， 2012， 31（4）： 81-83.
	HE X J， LI J， LI N T， et al. Ammonium persulfate and enzyme technology comparative study gel breaking fracturing［J］. Petrochem Ind Appl， 2012， 31（4）： 81-83.
8	王文军，张士诚，温海飞，等. 浅层水平井超低温压裂液体系研究与应用［J］. 油田化学， 2012， 29（2）： 155-158.
	WANG W J， ZHANG S C， WEN H F， et al. Study and application of fracturing fluid for ultra-low temperature in shallow buried fracturing horizontal wells［J］. Oilfield Chem， 2012， 29（2）： 155-158.
9	李风光. 浅层低渗透油气井超低温压裂液体系研究［J］. 油气井测试， 2021， 30（5）： 37-43.
	LI F G. Study on ultra-low temperature fracturing fluid system for shallow oil and gas wells with low permeability［J］. Well Testing， 2021， 30（5）： 37-43.
10	韩卓，郭威，张太亮，等. 非常规压裂返排液回注处理实验研究［J］. 石油与天然气化工， 2014， 43（1）： 108-112.
	HAN Z， GUO W， ZHANG T L， et al. Experimental study on reinjection treatment of unconventional fracturing flow-back fluid［J］.Chem Eng Oil Gas， 2014， 43（1）： 108-112.
11	SRIVASTAVA P K， KAPOOR M. Production， properties， and applications of endo-β-mannanases［J］. Biotechnol Adv， 2017， 35（1）： 1-19.
12	SONI H， GANAIE M A， PRANAW K， et al. Design-of-experiment strategy for the production of mannanase biocatalysts using plamkarnel cake and its application to degrade locust bean and guar gum［J］. Biocatal Agric Biotechnol， 2015， 4（2）： 229-234.
13	MOREIRA L， FILHO E. An overview of mannan structure and mannan-degrading enzyme systems［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 79（2）： 165-178.
14	CAROL M， UTCHEN M C. Characterization of extremely thermostable enzymatic breakers （α-1，6-galactosidase and β-1，4-mannanase） from the hyperthermophilic bacterium Thermotoganeapolitana5068 for hydrolysis of guar gum［J］. Biotechnol Bioeng， 1996， 52（2）： 332-339.
15	KLYOSOV A A， DOTSENKO G S， HINZ S W A， et al. Structural features of β-（1→4）-D-galactomannans of plant origin as a probe for β-（1→4）-mannanase polymeric substrate specificity［J］. Carbohydr Res， 2012， 352： 65-69.
16	SRIVASTAVA P K， KAPOOR M. Production， properties， and applications of endo-β-mannanases［J］. Biotechnol Adv， 2016， 35（1）： 1-19.
17	张蕊，朱虹，周峻沛，等. β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展［J］. 中国农业科技导报， 2018， 20（5）： 34-46.
	ZHANG R， ZHU H， ZHOU J P， et al. Research progress on molecular biology of β-mannanases［J］. J Agric Sci Technol， 2018， 20（5）： 34-46.
18	BEHERA S， DEV M J， SINGHAL R S. Cross-linked beta-mannanase aggregates： preparation， characterization， and application for producing partially hydrolyzed guar gum［J］. Appl Biochem Biotechnol， 2022， 194（5）： 1981-2004.
19	COMFORT D A， CHHABRA S R， CONNERS S B， et al. Strategic biocatalysis with hyperthermophilic enzymes［J］. Green Chem， 2004， 6（9）： 459-465.
20	MAHAMMAD S， COMFORT D A， KELLY R M， et al. Rheological properties of guar galactomannan solutions during hydrolysis with galactomannanase and alpha-galactosidase enzyme mixtures［J］. Biomacromolecules， 2007， 8（3）： 949.
21	丁铮，王静，潘永强，等. 生物酶对高黏度压裂返排液破胶处理研究［J］. 现代化工， 2015， 35（12）： 71-74.
	DING Z， WANG J， PAN Y Q， et al. Research of enzyme for gel breaking of high viscosity fracturing flow-back fluid［J］. Mod Chem Ind， 2015， 35（12）： 71-74.
22	BLIBECH M， FARHAT-KHEMAKHEM A， KRIAA M， et al. Optimization of beta-mannanase production by Bacillus subtilis US191 using economical agricultural substrates［J］. Biotechnol Prog， 2020， 36（4）： 1-9.
23	CHAUHAN P S， PURI N， SHARMA P， et al. Mannanases： microbial sources， production， properties and potential biotechnological applications［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2012， 93（5）： 1817-1830.
24	DAWOOD A， MA K. Applications of microbial β-mannanases ［J］. Front in Bioeng Biotechnol， 2020， 8（598630）： 1-17.
25	郑允志，王冰，王兴刚. β-甘露聚糖酶对夏季高温蛋鸡生产性能、蛋品质和养分表观消化率的影响［J］. 中国饲料， 2018（16）： 42-45.
	ZHENG Y Z， WANG B， WANG X G. Dietary supplementation of β-mannanase on laying performance， egg qualityand apparent digestibility of nutrients in laying hens under hot climatic condition［J］. China Feed， 2018（16）： 42-45.
26	谈苏慧，卢海强，陈伟，等. 1株产甘露聚糖酶嗜热真菌的鉴定、酶学性质表征及转录组学分析［J］. 食品科学， 2021， 42（18）： 65-72.
	TAN S H， LU H Q， CHEN W， et al. Identification， enzymatic characterization and transcriptomic analysis of a mannanase-producing thermophilic fungus［J］. Food Sci， 2021， 42（18）： 65-72.
27	施鑫磊，方韵颖，尉俏女，等. 一种来源于喜热梭孢壳的耐热型β-甘露聚糖酶［J］. 微生物学报， 2021， 61（9）： 2815-2828.
	SHI X L， FANG Y Y， WEI Q N， et al. Characterization of a hyperthermostable β-mannanase from Thermothelomyces thermophilus［J］.Acta Microbiol Sin， 2021， 61（9）： 2815-2828.
28	谢家仪，董光军，刘振英. 扫描电镜的微生物样品制备方法［J］. 电子显微学报， 2005， 24（4）： 440.
	XIE J Y， DONG G J， LIU Z Y. Method of preparation of microbiological specimen for scanning electron microsope［J］. J Chin Electron Microsc Soc， 2005， 24（4）： 440.
29	MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］. Anal Biochem， 1959， 31（3）： 426-428.
30	KATROLIA P， ZHOU P， ZHANG P， et al. High level expression of a novel β-mannanase from Chaetomium sp. exhibiting efficient mannan hydrolysis［J］. Carbohydr Polym， 2012， 87（1）： 480-490.
31	BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Anal Biochem， 1976， 72（1）： 248-254.
32	DOWNIE B， HILHORST H， BEWLEY J D. A new assay for quantifying endo-beta-D-mannanase activity using congo red dye［J］. Phytochemistry， 1994， 36（4）： 829-835.
33	ZHOU J， ZHANG R， GAO Y， et al. Novel low-temperature-active， salt-tolerant and proteases-resistant endo-1，4-β-mannanase from a new Sphingomonas strain［J］. J Biosci Bioeng， 2012， 113（5）： 568-574.
34	HUANG J L， BAO L X， ZOU H Y， et al. High-level production of a cold-active β-mannanase from Bacillus subtilis BS5 and its molecular cloning and expression［J］. Mol Genet Microbiol Virol， 2012， 27（4）： 14-17.
35	PONGSAPIPATANA N， DAMRONGTEERAPAP P， CHANTORN S， et al. Molecular cloning of kman coding for mannanase from Klebsiella oxytoca KUB-CW2-3 and its hybrid mannanase characters［J］. Enzyme Microb Technol， 2016， 89： 39-51.
36	YOU J， LIU J F， YANG S Z，et al. Low-temperature-active and salt-tolerant beta-mannanase from a newly isolated Enterobacter sp. strain N18［J］. J. Biosci Bioeng， 2016， 121（2）： 140-146.
37	LI C Y， LIU F F， YE J， et al. A low-temperature active endo-β-1，4-mannanase from Bacillus subtilis TD7 and its gene expression in Escherichia coli［J］. Appl Environ Biostechnol， 2018， 3（2）： 17-25.
38	陈英，王亚南，陈绍宁，等. 用于压裂液的生物酶破胶剂性能评价［J］. 钻井液与完井液， 2010， 27（6）： 68-71.
	CHEN Y， WANG Y N， CHEN S N， et al. Evaluation of bio-enzyme breaker used in fracturing fluid［J］. Drill Fluid Completion Fluid， 2010， 27（6）： 68-71.
39	高敏，江建林. 水基压裂液体系的制备及性能［J］. 石油化工， 2020， 49（12）： 1188-1193.
	GAO M， JIANG J L. Preparation and properties of a water-based fracturing fluid system［J］. Petrochem Technol， 2020， 49（12）： 1188-1193.
40	BATTISTEL E， BIANCHI D， FORNAROLI M， et al. Enzymes breakers for viscosity enhancing polymers［J］. J Pet Sci Eng， 2011， 77（1）： 10-17.
41	李军，王潜，齐海鹰，等. 新型生物酶破胶剂的研究与应用［J］. 石油矿场机械， 2008， 37（10）： 90-92.
	LI J， WANG Q， QI H Y， et al. Development and application of new biological enzyme gel breaker［J］. Oil Field Equip， 2008， 37（10）： 90-92.