银染高尔基染色法用于神经元完整结构成像

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.230305

摘要/Abstract

摘要：

高尔基染色是神经元树突和树突棘可视化的经典方法，目前仍被广泛用于神经元形态可视化。银高尔基染色目前存在易产生黑色沉淀、染色神经元形态结构不完整等问题。对重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）和硝酸银（AgNO₃）如何影响银染高尔基染色方法的染色效果进行了研究，通过研究染色液组成成分重铬酸钾、硝酸银质量浓度变化和组分的不同作用方式，实现了对银染高尔基染色方法的优化。结果表明，35 mg/mL多聚甲醛（Paraformaldehyde， PFA）和20 mg/mL K₂Cr₂O₇混合液染色效果要明显优于20 mg/mL K₂Cr₂O₇单独染色效果，在K₂Cr₂O₇的质量浓度优化过程中，80 mg/mL K₂Cr₂O₇的染色效果最佳，35 mg/mL PFA与20 mg/mL K₂Cr₂O₇混合溶液和80 mg/mL K₂Cr₂O₇最佳染色时长比为3∶1，染色过程中AgNO₃的最佳质量浓度为10 mg/mL，在最终的染色液组成成分以及作用方式中40 mg/mL PFA固定2 d、35 mg/mL PFA和20 mg/mL K₂Cr₂O₇混合溶液处理3 d、80 mg/mL K₂Cr₂O₇处理1 d和10 mg/mL AgNO₃处理5 d对脑组织神经元形态的可视化具有最佳效果。优化后的银染高尔基染色方法可实现对神经元的完整形态结构染色，同时在染色过程也将产生更少的成像杂质沉淀噪点。该工作将提供一种新的高尔基改良染色方法，实现神经元完整形态结构的染色，有望为研究脑神经元结构变化与脑疾病之间的关系提供新的染色方法。

关键词: 重铬酸钾, 硝酸银, 神经元形态, 银染高尔基染色

Abstract:

Golgi staining is a classical method for visualization of neuronal dendrites and dendritic spines and is still widely used for neuronal morphology visualization. Silver Golgi staining currently suffers from problems such as the tendency to produce black precipitation and incomplete morphological structure of stained neurons. We investigated how potassium dichromate （K₂Cr₂O₇） and silver nitrate （AgNO₃） affect the staining effect of the silver Golgi staining method， and realized the optimization of the silver Golgi staining method by studying the change of the mass concentration of the staining solution constituents， potassium dichromate， and silver nitrate， and the different modes of action of the components. The results showed that： the staining effect of the mixture of 35 mg/mL paraformaldehyde （PFA） and 20 mg/mL K₂Cr₂O₇ was significantly better than that of 20 mg/mL K₂Cr₂O₇ alone， and during the optimization process of the mass concentration of K₂Cr₂O₇， the best staining effect was achieved by 80 mg/mL K₂Cr₂O₇， and the staining effect of 35 mg /mL PFA mixed with 20 mg/mL K₂Cr₂O₇ and 80 mg/mL K₂Cr₂O₇ optimal staining duration ratio was 3：1， the optimal mass concentration of AgNO₃ during the staining process was 10 mg/mL， and in the final staining solution composition and the mode of action of 2 days 40 mg/mL PFA fixation， 3 days 35 mg/mL PFA and 20 mg/mL K₂Cr₂O₇， 40 mg/mL PFA fixation， 3 days 35 mg/mL PFA and 20 mg/mL K₂Cr₂O₇， and 2 days 35 mg/mL PFA and 20 mg/mL K₂Cr₂O₇. PFA and 20 mg/mL K₂Cr₂O₇ mixed solution for 3 days， 80 mg/mL K₂Cr₂O₇ for 1 day and 10 mg/mL AgNO₃ for 5 days had the best effect on the visualization of neuronal morphology in brain tissue. The optimized silver-stained Golgi staining method will achieve complete morphological structural staining of neurons， and will also produce less imaging impurity precipitation noise during the staining process. This work will provide a new modified Golgi staining method to achieve staining of the complete morphological structure of neurons. This optimized method is expected to provide a new staining method for studying the relationship between structural changes of brain neurons and brain diseases.

Key words: Potassium dichromate, Silver nitrate, Neuronal morphology, Silver Golgi staining

中图分类号:

O611

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图/表 5

图1 染色流程示意图

Fig.1 Schematic diagram of staining process

图2 PFA与K2Cr2O7混合液染色不同时长后的光学显微镜成像结果。（A） 20 mg/mL K2Cr2O7溶液染色2 d，（B） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色2 d，（C） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色4 d，（D） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色5 d，（E） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色6 d，（F） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色8 d，（G）神经元形态Sholl分析。红色椭圆虚线框：黑色沉淀；蓝色椭圆虚线框：有方向性的神经纤维；红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构。A. 20 mg/mL K2Cr2O7 for 2 d； B. 35 mg/mL PFA mixed with 20 mg/mL K2Cr2O7 for 2 d； C. 35 mg/mL PFA mixed with 20 mg/mL K2Cr2O7 for 4 d； D. 35 mg/mL PFA mixed with 20 mg/mL K2Cr2O7 for 5 d； E. 35 mg/mL PFA was mixed with 20 mg/mL K2Cr2O7 for 6 d； F. 35 mg/mL PFA was mixed with 20 mg/mL K2Cr2O7 for 8 d； G. Sholl analysis of neuronal morphology. red oval dashed box： black deposits； blue oval dashed box： directional nerve fiber； red rectangular dashed box： neuronal structure with soma and dendritic structures

Fig.2 Optical microscopy imaging results of PFA-K2Cr2O7 mixture after staining for different time durations

图3 不同质量浓度K2Cr2O7染色后的光学显微镜成像图。K2Cr2O7质量浓度分别为（A） 20 mg/mL、（B） 40 mg/mL、（C） 60 mg/mL和（D） 80 mg/mL，（E）神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框：黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框：有方向性的神经纤维，红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框：血管结构

Fig.3 Optical microscopy imaging of K2Cr2O7 stained with different mass concentrations K2Cr2O7. K2Cr2O7 mass concentrations of （A） 20 mg/mL，（B） 40 mg/mL，（C） 60 mg/mL and （D） 80 mg/mL，（E） Sholl analysis of neuronal morphology， red oval dashed box： black deposits， blue oval dashed box： directional nerve fibers， red rectangular dashed box： neuronal structures with soma and dendritic structures， blue rectangular dashed box： vascular structures

图4 不同染色时长比例染色后的光学显微镜成像图PFA与K2Cr2O7混合溶液和K2Cr2O7溶液染色时长比例分别为0∶4（A）、1∶3（B）、2∶2（C）、3∶1（D）和4∶0（E），（F）神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框：黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框：不完整的神经元结构，红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框：血管结构

Fig. 4 Optical microscope imaging of the tissue under different staining time ratioPFA mixed solution with K2Cr2O7 and K2Cr2O7 solution staining time ratios were 0∶4 （A）， 1∶3 （B）， 2∶2 （C）， 3∶1 （D）， 4∶0 （E），（F） Sholl analysis of neuronal morphology， red oval dashed box： black deposits， blue oval dashed box： incomplete neuronal structures， red rectangular dashed box： neuronal structures with soma and dendritic structures， blue rectangular dashed box： vascular structures

图5 不同质量浓度AgNO3染色后的光学显微镜成像图。AgNO3质量浓度分别为5（A）、7.5（B）、10（C）、12.5（D）、15（E）和20 mg/mL（F），染色后的光学显微镜成像图，（G）神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框：黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框：不完整的神经元结构，红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框：血管结构

Fig.5 Optical microscopy imaging of stained with different mass concentrations AgNO3. AgNO3 mass concentrations of 5 （A）， 7.5 （B）， 10 （C）， 12.5 （D）， 15 （E） and 20 mg/mL （F），（G） Sholl analysis of neuronal morphology， red oval dashed box： black deposits， blue oval dashed box： incomplete neuronal structures， red rectangular dashed box： neuronal structures with soma and dendritic structures， blue rectangular dashed box： vascular structures

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