氟功能化胆碱磷酸脂质体用于胰岛素的口服给药

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220384

摘要/Abstract

摘要：

皮下注射胰岛素（INS）作为治疗糖尿病主要的治疗方式，存在使用抵触和低血糖等副作用，而开发口服给药途径更具有应用前景。脂质体作为最成熟的药物递送体系，在蛋白或多肽口服给药方面存在着稳定性差、载药率低和粘液渗透有限等问题。基于细胞膜骨架成分磷酸酰胆碱（PC）设计合成了三氟乙基修饰两性离子头部的二棕榈酰胆碱磷酸脂质分子（DPFCP），并构建了负载胰岛素口服给药的脂质体递送体系（INS@DPFCP）。对比二棕榈酰磷脂酰胆碱（INS@DPPC）和未功能化二棕榈酰胆碱磷酸（INS@DPCP）脂质体，系统地研究了INS@DPFCP理化性质、释放药物稳定性、粘液渗透性、生物相容性和细胞内吞效率及转运能力等。结果表明，INS@DPFCP的粒径为185 nm，包封率为（47.1±3.9）%。相比于INS@DPPC（27.2%）和INS@DPCP（24.5%），INS@DPFCP粘液聚集量仅有17.15%。溶血和细胞毒性实验证明， INS@DPFCP具有良好的生物相容性，质量浓度高达1.2 mg/mL时，溶血率为6.88%，细胞存活率在90%以上。此外，细胞摄取及转运测试表明，Caco-2细胞对INS@DPFCP具有更高的细胞摄取效率， 4 h的药物转运量达到47.5%。因此， INS@DPFCP可以满足口服递送的性质需求，有望在糖尿病治疗中发挥重要作用，在蛋白或多肽给药领域具有潜在的应用前景。

关键词: 胆碱磷酸脂质体, 氟功能化, 胰岛素, 口服给药

Abstract:

Subcutaneous insulin （INS） injection as the main therapy method for diabetes shows adverse effects such as inconvenient use and hypoglycemia. Fortunately， the oral route of administration of insulin possesses more application potential. As one of the most mature drug delivery systems， liposomes exist some disadvantages in the oral administration of proteins or peptides， such as poor stability， low drug load， and limited mucus penetration. Herein， according to the phosphocholine （PC） component of the cell membrane， choline phospholipid with trifluoroethyl modified zwitterionic head （DPFCP） is designed and synthesized for constructing liposomes delivery system loaded with insulin （INS@DPFCP） for oral administration. By comparison with phosphate choline liposomes （INS@DPPC） and unfunctionalized choline phosphate liposomes （INS@DPCP）， the physicochemical properties， drug release stability， mucus permeability， biocompatibility， endocytosis， and transport ability of INS@DPFCP are studied. The test results indicate that the particle size of INS@DPFCP is 185 nm， and drug entrapment efficiency is （47.1±3.9）%. Compared with INS@DPPC （27.2%） and INS@DPCP （24.5%）， the amount of mucus aggregation for INS@DPFCP is 17.15%. Hemolysis and cytotoxicity experiments show that INS@DPFCP gets good biocompatibility. When the mass concentration is as high as 1.2 mg/mL， the hemolysis rate is 6.88%， and the cell viability is above 90%. In addition， the endocytosis assay results demonstrate that INS@DPFCP is proved to be higher cellular uptake efficiency of Caco-2 cells， and the drug delivery accumulation reaches 47.5% in 4 h. INS@DPFCP is expected to play an important role in diabetes treatment， and shows potential application in the field of proteins or peptides oral administration.

Key words: Choline phosphate liposomes, Fluoride-functionalized, Insulin, Oral administration

中图分类号:

O623

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图/表 8

图1 DPPC、DPCP和DPFCP脂质分子结构及其负载胰岛素的脂质体示意图

Fig.1 Schematic illustration of the molecular structures of DPPC， DPCP and DPFCP lipids and their insulin-loaded liposomes

图2 DPFCP的合成路线

Fig 2 The synthesis routes of DPFCP

图3 DPFCP的1H、31P及19F NMR（A）和ESI-MS（B）谱图

Fig.3 The 1H， 31P and 19F NMR （A）， and ESI-MS （B） spectra of DPFCP

图4 （A） INS@DPPC、INS@DPCP、DPFCP及INS@DPFCP脂质体的粒径分布（pH=7.4）；在不同pH值（1.0、2.0、4.0、6.0、7.4和9.0）溶液中2 h的（B）粒径变化及（C）Zeta电势变化；（D）INS@DPFCP脂质体的透射电子显微镜照片；（E）DPPC、DPCP和DPFCP的相转变温度

Fig.4 （A） The size distribution （pH=7.4） of INS@DPPC， INS@DPCP， DPFCP and INS@DPFCP liposomes；（B） Size change and （C） Zeta potential change in different pH （1.0， 2.0， 4.0， 6.0， 7.4 and 9.0） solution for 2 h of DPPC， DPCP， DPFCP and INS@DPFCP liposomes；（D） TEM images of INS@DPFCP liposomes；（E） Tm of DPPC， DPCP and DPFCP

表1 INS@DPPC、INS@DPCP、DPFCP和INS@DPFCP脂质体的粒径、PDI、Zeta电势、包封率和载药率

Table 1 The size， PDI， Zeta potential， DLE and DLC of INS@DPPC， INS@DPCP， DPFCP and INS@DPFCP liposomes

Sample	Size/nm	PDI	Zeta potential/mV	DLE/%	DLC/%
INS@DPPC	157	0.219	-22.1±1.8	45.2±2.3	3.39±0.41
INS@DPCP	169	0.223	-24.6±1.2	42.7±1.2	3.2±0.68
DPFCP	163	0.236	-10.3±2.5	/	/
INS@DPFCP	185	0.247	-18.9±2.7	47.1±3.9	3.53±0.35

图5 INS@DPPC、INS@DPCP和INS@DPFCP 脂质体在37 ℃， PBS缓冲溶液中（A）累积释放情况；（B）模拟胃液（0~2 h）和模拟肠液（2~6 h）中酶降解情况；（C）标准胰岛素和INS@DPFCP释放胰岛素的CD曲线；（D）20 d内， 4 ℃中INS@DPFCP 脂质体的粒径及包封率变化； DPCP-CTAC、DPPC、DPCP和DPFCP在粘蛋白溶液2 h内的（E）聚集量和（F）表观渗透系数

Fig.5 （A） The cumulative release and （B） the enzymatic degradation in SGF（0~2 h） and SIF（2~6 h） of INS@DPPC， INS@DPCP and INS@DPFCP liposomes in PBS buffer solution at 37 ℃；（C） CD curves of standard insulin and released insulin of INS@DPFCP；（D） Changes in size and encapsulation efficiency of INS@DPFCP liposomes at 4 ℃ for 20 d；（E） Aggregation and （F） Papp of DPCP-CTAC， DPPC， DPCP and DPFCP in mucin solution for 2 h

图6 （A、B）不同浓度DPPC、DPCP及DPFCP脂质体与小鼠红细胞孵育2 h后的溶血率； DPPC、DPCP及DPFCP脂质体与Caco-2细胞（C）和NIH-3T3细胞（D）孵育24 h后的细胞存活率

Fig.6 （A， B） Hemolysis of different concentrations of DPPC， DPCP and DPFCP liposomes after 2 h incubation with mouse RBC； The cell viability to Caco-2 cells （C） and NIH-3T3 cells （D） fed by DPPC， DPCP and DPFCP liposomes for 24 h

图7 Free INS、INS@DPPC、INS@DPCP和INS@DPFCP脂质体与Caco-2细胞孵育2 h（A）和4 h（B）的流式实验结果和4 h后的CLSM图像（C），比例尺为20 μm；以及与Caco-2细胞的单层细胞膜模型孵育4 h的（D）累积转运量和（E）表观渗透系数

Fig.7 Flow cytometric analysis in treated Caco-2 cells with Free INS， INS@DPPC， INS@DPCP and INS@DPFCP liposomes for （A） 2 h and （B） 4 h， and （C） CLSM images for 4 h， scale bar is 20 μm；（D） The cumulative transport volume and （E） Papp of the monolayer cell membrane model of Caco-2 cells for 4 h

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