基于上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.230083

摘要/Abstract

摘要：

基于NaYF₄∶Yb³⁺，Tm³⁺@NaYF₄上转换纳米颗粒（Upconversion nanoparticles， UCNPs）和DNA催化发夹组装（Catalytic hairpin reaction， CHA）技术构建近红外激发（Near-infrared， NIR）荧光生物传感器，用于microRNA的高灵敏分析。靶标microRNA-21（miRNA-21）可与磁珠（Magnetic beads， MBs）表面修饰的发夹H1发生toehold区域介导的链取代反应，发夹H1暴露新的toehold区域与UCNPs表面修饰的发夹H2发生反应，形成H1/H2复合物，同时miRNA-21被取代并与新的发夹H1反应，此过程将UCNPs固定于MBs表面，而且实现了信号的循环放大。接下来通过磁分离技术，将固定于MBs表面的UCNPs分离出来，在808 nm NIR的激发下产生上转换发光（Upconversion luminescence， UCL），对miRNA-21的检测范围为0.1~100 nmol/L，检出限为11.3 pmol/L。此外，该荧光生物传感器成功应用于血清样本中miRNA-21的分析，表明其具有良好的实用性。

关键词: 上转换纳米颗粒, 催化发夹组装, 荧光生物传感器, microRNA, 近红外光

Abstract:

In this work， a near-infrared light （NIR）-driven fluorescence biosensor is proposed based on the upconversion beacon probe and catalytic hairpin reaction （CHA） for the detection of microRNA. The target microRNA-21 （miRNA-21） can trigger the CHA reaction between the DNA hairpin H1 modified on magnetic beads （MBs） and the DNA hairpin H2 modified on upconversion nanoparticles （UCNPs）， resulting in the introduction of UCNPs on the surface of MBs accompanied by the cyclic signal amplification. Through magnetic separation， the UCNPs fixed on MBs are separated and generate upconversion luminescence （UCL） under the excitation of 808 nm NIR， which shows the advantages of good luminescence stability and negligible photodamage. In this biosensor， the linear range of miRNA-21 is 0.1 to 100 nmol/L with the detection limit of 11.3 pmol/L. In addition， this fluorescence biosensor achieves the detection of miRNA-21 in serum samples， showing good practicability.

Key words: Upconversion nanoparticles, Catalytic hairpin reaction, Fluorescence biosensor, MicroRNA, Near-infrared light

中图分类号:

O655

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图/表 9

图1 基于UCNPs和CHA信号放大策略的荧光生物感器检测miRNA-21示意图

Fig.1 Schematic of fluorescence biosensor based on UCNPs and CHA amplification strategy for the detection of miRNA-21

表 1 工作中用到的核苷酸序列

Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this study

Name	Sequence（5'-3'）
miRNA-21	UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A
miRNA-155	UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU
H1	AGA CTG ATG TTG ACT TAG CTT ATC GAT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA-NH₂
H2	ACT TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG ATC GAT AAG CTA AGT CAA CTA CA
Single-base mismatched miRNA-21	UAT CUU AUC AGA CUG AUG UUG A
Three-base mismatched miRNA-21	UAT CUA AUU AGA CUG AUG UUG A

图2 （A）MBs的SEM图。（B）NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs和（C）NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs的TEM图。（D） NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs的XPS表征。（E） Y3d和（F）F1s轨道的高分辨XPS图谱。（G）去除OA的UCNPs和（H） H2-UCNPs的TEM图。H2-UCNPs的（I）HRTEM和（J）EDS表征。（K）去除OA的 UCNPs和H2-UCNP的Zeta电位表征。（L） NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs（a）、NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs（b）和H2-UCNPs（c）的XRD表征。（M） 808 nm NIR激发下NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs（a）、NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs（b）和H2-UCNPs（c）的UCL光谱

Fig.2 （A） SEM image of MBs. TEM images of （B） NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs and （C） NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs. （D） XPS survey spectrum of NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs. High-resolution XPS spectra of （E） Y3d and （F） F1s. TEM images of （G） OA-free UCNPs and （H） H2-UCNPs. （I） HRTEM and （J） EDS elemental mapping of H2-UCNPs. （K） Zeta potential of OA-free UCNPs and H2-UCNPs. （L） XRD spectrum of NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs （a）， NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs （b） and H2-UCNPs （c）. （M） UCL spectra of NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs （a）， NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs （b） and H2-UCNPs （c） under 808 nm NIR

图3 非变性聚丙烯凝胶电泳表征CHA反应过程。泳道1： miRNA-21；泳道2： H1；泳道3： miRNA-21+H1；泳道4： miRNA-21+H1+H2；泳道5： H1+H2

Fig.3 Native PAGE for the characterization of CHA process. Lane 1： miRNA-21； lane 2： H1； lane 3： miRNA-21+H1； lane 4：miRNA-21+H1+H2； lane 5： H1+H2

图4 （A） MBs上H1浓度优化和（B） CHA反应时间优化

Fig.4 （A） Optimization of H1 concentrations on MBs and （B） reaction time of CHA reaction

图5 （A）采用所构建的近红外荧光生物传感检测不同浓度miRNA-21的UCL光谱。（B） UCL强度与miRNA-21浓度对数的线性关系图

Fig.5 （A） UCL spectra toward miRNA-21 with different concentrations using the proposed NIR fluorescence biosensor. （B） Corresponding linear relationship between UCL intensity and logarithm of miRNA-21 concentration

表2 不同传感体系的检测性能比较

Table 2 Comparison of performance of different sensing system

Methods	Linear range/（nmol·L^-１）	Detection limit/（pmol·L^-1）	Ref.
Fluorescence	0.1~16	93.8	［16］
Fluorescence	0.5~150	83.0	［31］
Fluorescence	0.1~300	67.0	［32］
Fluorescence	2.5~80	250.0	［33］
Electrochemistry	0.1~10⁴	83.0	［34］
Fluorescence	0.1~100	11.3	This work

图6 所构建近红外荧光生物传感器的（A）特异性和（B）储存稳定性

Fig.6 （A） Specificity and （B） storage stability of the constructed NIR fluorescence biosensor

表 3 采用所构建的近红外荧光传感器检测血清中miRNA-21

Table 3 Detection of miRNA-21 in human serum by NIR-driven fluorescence biosensor

Num	Added/（nmol·L^-1）	Measured value/（nmol·L^-1）	RSD/%（n=3）	Recovery/%
1	0	0.06	0.55	-
2	0.7	0.72	0.84	103.41
3	7	7.13	0.41	101.86
4	70	70.79	1.02	101.14

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