生物样品中小檗碱的电化学分析新方法

doi:10.19894/j.issn.1000-0518.220397

摘要/Abstract

摘要：

由于小檗碱氧化电位较高（＞1.1 V vs.Ag/AgCl），进行生物样品中小檗碱的选择性电化学分析具有挑战性。基于溴百里酚蓝（BTB）和小檗碱的分子间非共价作用，通过单壁碳纳米管（SWNTs）将BTB修饰在电极表面并通过电化学聚合产生poly-BTB，利用聚BTB（poly-BTB）电极过程可逆以及氧化还原电位低的特点，以poly-BTB同时作为小檗碱的识别元件和电化学探针建立了小檗碱的电化学分析新方法。循环伏安和电化学阻抗谱结果表明，poly-BTB和小檗碱的分子间作用导致小檗碱结合在poly-BTB/SWNTs修饰电极表面，从而引起修饰电极的峰电流下降。在最优化的实验条件下，poly-BTB/SWNTs修饰电极的电流下降率和小檗碱的浓度在0.05~1 μmol/L和1~100 μmol/L范围内呈良好线性关系，检测限为0.022 μmol/L。动物实验结果表明，该方法对生物样品具有很好的选择性，可用于血浆和肝脏匀浆中小檗碱含量的测量，为小檗碱相关的生理病理研究提供了一种简单有效的方法。

关键词: 小檗碱, 溴百里酚蓝, 非共价作用, 电化学分析方法

Abstract:

Selective electrochemical detection of berberine in biological fluids is challenging due tothe high overpotential for berberine electrooxidation （＞1.1 V vs.Ag/AgCl）. By taking advantage of the non-covalent interactions between bromothymol blue （BTB） and berberine， and the reversible and low-potential electrochemical redox properties of polymerized BTB （poly-BTB）， we report a new electrochemical method for berberine detection using poly-BTB as both the recognition unit for berberine and electrochemical probe， in which poly-BTB is generated by electropolymerization of BTB immobilized onto the GC electrode surface via single-walled carbon nanotubes （SWNTs）. The strong affinity of poly-BTB toward berberine leads to the binding of berberine onto the electrode surface and consequently causes the decrement in the peak current of poly-BTB/SWNTs-modified electrode upon berberine being introduced， which validates berberine detection using the current decrease of the poly-BTB/SWNTs/GC electrode as the signal readout. Under the optimized conditions， the method shows linear concentration of berberine in the range of 0.05~1 μmol/L and 1~100 μmol/L with a detection limit of 0.022 μmol/L based on 3σ. As for the animal experiments， the electrochemical method has been demonstrated to be selective and effective for berberine level qualification in rat plasma and liver homogenates. This study offers a facile electrochemical method for berberine detection in biological fluids with less technical demanding and simple operating procedures， which holds a great promise for more applications in physiological and pathological researches associated with berberine.

Key words: Berberine, Bromothymol blue, Noncovalent interaction, Electrochemical method

中图分类号:

O657.1

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图/表 8

图1 小檗碱（berberine）和溴百里酚蓝（BTB）的化学结构式，以及基于聚溴百里酚蓝（poly-BTB）修饰电极的小檗碱电化学分析策略示意图

Fig.1 Chemical structures of berberine and BTB， and schematic illustration of the strategy for electrochemical detection of berberine based on poly-BTB modified electrode

图2 SWNTs/GC 电极在BR空白缓冲溶液（pH=5.0）中（a）和含有500 μmol/L小檗碱的BR缓冲溶液（pH=5.0）（b）中的循环伏安图，扫速：50 mV/s

Fig.2 Typical cyclic voltammograms （CVs） obtained at the SWNTs/GC electrode in BR buffer solution of pH=5.0 in the absence （a） and presence of 500 μmol/L berberine （b）. Scan rate is 50 mV/s

图3 BTB/SWNTs/GC电极（A）和poly-BTB/SWNTs/GC电极（B）在BR缓冲溶液（pH=5.0）中分别扫描20圈和50圈的循环伏安图，扫速：50 mV/s。图3A红线代表第1圈，箭头的方向代表扫描次数从第1圈到第20圈增加的方向。右下角插图部分为第15~20圈的局部放大图

Fig.3 Successive 20-cycle CV at the BTB/SWNTs/GC electrode （A） and successive 50-cycle CV at poly-BTB/SWNTs/GC electrode （B） in BR buffer solution of pH=5.0. Scan rate is 50 mV/s. The red curve in Fig.3A represents the first cycle of the CV， and the arrows indicate the directions of the cycle numbers from 1 to 20 in Fig.3A. The insert shows the magnification of the 15th to 20 th cycles of the CVs in Fig.3A

图4 （A） Poly-BTB/SWNTs/GC电极在BR缓冲溶液（pH=5.0）中与小檗碱孵育20 min前（a）和孵育20 min后（b）、SWNTs/GC电极与小檗碱孵育20 min后（c）的循环伏安图。扫速： 50 mV/s。（B） SWNTs/GC电极（a）、poly-BTB/SWNTs/GC电极（b）和poly-BTB/SWNTs/GC电极与小檗碱孵育后（c）在含0.1 mol/L KCl的相同浓度（5.0×10－3 mol/L） K3［Fe（CN）6］和K4［Fe（CN）6］混合溶液中的Nyquist图（B） Typical Nyquist plots of SWNTs/GC electrode （a）， poly-BTB/SWNTs/GC electrode before （b）， and after incubation with 500 μmol/L berberine （c） in 0.1 mol/L KCl containing an equimolar （5.0×10－3 mol/L） mixture of K3［Fe（CN）6］ and K4［Fe（CN）6］

Fig.4 （A） Typical CVs obtained at the poly-BTB/SWNTs/GC electrode （a， b） and SWNTs/GC electrode （c） in BR buffer solution of pH=5.0 before （a） and after （b， c） 20 min incubation with 500 μmol/L berberine. Scan rate is 50 mV/s；

图5 Poly-BTB/SWNTs/GC电极和500 μmol/L小檗碱孵育0、1、3、5、10、15、20、25、30和35 min后在BR缓冲溶液（pH=5.0）中的循环伏安图，扫速：50 mV/s。箭头方向代表孵育时间增长的方向。插图为电流下降率与孵育时间的关系曲线

Fig.5 Typical CVs obtained at the poly-BTB/SWNTs/GC electrode in BR buffer solution of pH=5.0 after incubation with 500 μmol/L berberine for 0， 1， 3， 5， 10， 15， 20， 25， 30 and 35 mins. Scan rate， 50 mV/s. The arrow indicates the direction of increasing of the incubation span. Inset the nonlinear plot of the ratio of current decrease versus incubation time

图6 Poly-BTB/SWNTs/GC电极在BR缓冲溶液（pH=5.0）中对不同浓度小檗碱电流响应的差分脉冲伏安图。插图部分为电流下降率与小檗碱浓度在0.05~1 μmol/L和1~100 μmol/L之间的线性图。红线代表未加入小檗碱的差分脉冲伏安图，箭头方向代表小檗碱浓度增加的方向

Fig.6 Typical DPVs obtained at poly-BTB/SWNTs-modified GC electrode in BR buffer solution of pH=5.0 upon addition of different concentrations of berberine. The arrow indicates the direction of increasing concentration of berberine. Inset： linear plot of the ratio of current decrease versus concentration of berberine in the ranges of 0.05~1 μmol/L and 1~100 μmol/L

图7 （A）Poly-BTB/SWNTs/GC电极在BR缓冲溶液（pH =5.0）（a）、和分别加入10 μL 大鼠空白血浆（b）、10 μL 灌胃1 h后（c）以及10 μL灌胃2 h后（d）的模型血浆的差分脉冲伏安图。（B）Poly-BTB/SWNTs/GC电极在BR缓冲溶液（pH=5.0）（a）和分别加入10 μL大鼠空白肝脏匀浆（b）、10 μL 3 h（c）的模型肝脏匀浆的差分脉冲伏安图

Fig.7 （A） Typical DPVs obtained at the poly-BTB/SWNTs-modified GC electrodes in BR buffer solution of pH=5.0 in the absence （a） and the presence of 10 μL blank plasma （b）， and 10 μL model plasma of rats after dosing of berberine for 1 h （c） and 2 h （d）. （B） Typical DPVs obtained at the poly-BTB/SWNTs-modified GC electrodes in BR buffer solution of pH=5.0 in the absence （a） and the presence of 10 μL blank liver homogenate （b） and 10 μL model plasma of rats after dosing of berberine for 3 h （c）

表1 血浆和肝脏匀浆中小檗碱的加标回收结果（n=3）

Table 1 Spike-and-recovery in plasma and liver homogenate（n=3）

0.20

51.08

0.20

19.37

50.49

102.2

101.5

96.9

100.9

2.0

4.6

3.2

1.6

参考文献 20

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