壳聚糖(食品级, 粉末状, 来自虾壳, 脱乙酰度97%, 平均相对分子质量2.0× 10⁵), 2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵(化学纯), 还原型辅酶I烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、DPPH均为Sigma公司产品, 番红花为生物染色素, 其它均为分析纯试剂。

Nexus型 FT-IR红外光谱仪(美国尼高力公司), KBr压片法测定。 AVANCE III^TM 500型Bruker 500 M核磁共振光谱仪(瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司), D₂O溶液中测定。 Vario MICRO cube型元素分析仪(德国Elmentar公司)。 722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2.1 HTCC的制备 称取壳聚糖(CTS)4.83 g, 加入异丙醇15 mL与蒸馏水45 mL, 在85 ℃水浴中与2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)(0.06 mol)磁力搅拌下反应一定时间(5 h), 反应完毕, 加入冰丙酮使产物从溶液中沉淀, 静置, 抽滤。 用丙酮乙醇的混合溶液(体积比4∶ 1)洗涤, 得到壳聚糖季铵盐(HTCC)。 产物在红外电热干燥箱内60 ℃下干燥6 h后备用。

1.2.2 CAHTCC的制备 称取一定质量(1 g左右)的壳聚糖季铵盐(HTCC), 加入20 mL的1-甲基-2-吡咯烷酮, 室温下搅拌, 待壳聚糖季铵盐溶解后加入2 mL的氯乙酰氯, 常温下搅拌反应24 h后, 加入过量乙醚, 使产物从溶液中析出, 静置, 抽滤。 乙醚洗涤, 得到氯乙酰化壳聚糖季铵盐(CAHTCC)。 产物在红外电热干燥箱内60 ℃下干燥6 h后备用。

1.2.3 PAHTCC的制备 称取一定质量(1 g左右)的氯乙酰化壳聚糖季铵盐(CAHTCC), 加入20 mL二甲基亚砜, 在60 ℃水浴中与1 mL吡啶搅拌反应一定时间(24 h), 将反应液倾入过量丙酮中, 产物从溶液中析出, 静置, 抽滤。 丙酮洗涤, 干燥, 得到双季铵化壳聚糖(PAHTCC)。

1.3.1 清除羟自由基(· OH)活性测定 用比色法来测量· OH的含量。参考文献[4]方法, 实验体系反应总体积为4.5 mL, 其中含磷酸钠盐缓冲液(pH=7.4)150 mmol/L, 磷酸缓冲液1 mL, 2 mmol/L EDTA-Fe 0.5 mL, 3%过氧化氢1 mL, 360 mg/L的番红花1 mL, 样品溶液1.0 mL, 以上分别加入试管中混匀, 置于37 ℃水浴锅中使其反应30 min后, 在520 nm处测定样品的吸光度, 空白组以1 mL蒸馏水替代供试样品, 对照组以1.0 mL蒸馏水和1 mL磷酸缓冲液替代过氧化氢和样品。 清除率为:

E/%= A样品-A空白A对照-A空白× 100

式中, A_样品、A_空白和A_对照分别为加入样品后的吸光度、空白组的吸光度和对照组的吸光度。

1.3.2 清除超氧阴离子自由基(· O2-)活性测定 参照文献[5]方法, 采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系。反应体系为3.0 mL的Tris-HCl缓冲液(16 mmol/L, pH=8.0), 其中含有78 μ mol/L NADH、50 μ mol/L NBT、10 μ mol/L PMS以及不同浓度的壳聚糖衍生物样品溶液。 超氧阴离子和NBT的显色反应采用分光光度法在560 nm波长测定吸光度。 在空白对照实验中, 用Tris-HCl缓冲液替换NADH。 实验结果以清除率(%)表示:

F/%= A-A1A-A0× 100

式中, A和A₁分别为空白和加入样品后的吸光度值, 参比值A₀=0。

1.3.3 清除DPPH自由基活性测定 采用DPPH法检测壳聚糖及其衍生物清除DPPH自由基的能力, 从而进一步验证样品的抗氧化能力^[6](注:由于壳聚糖原料在上述3种自由基清除测试方法中所述pH值条件下不溶, 采用的方法为, 壳聚糖原料液在超声波条件下分散, 采用跟其它样品完全一样的操作后, 离心, 取上清液测试相应波长下的吸光度)。

图1比较了壳聚糖及其衍生物HTCC、CAHTCC和PAHTCC的红外光谱。 894和1154 cm^-1处为壳聚糖的多糖骨架吸收峰, 氨基的吸收峰在1600 cm^-1[7]处。 图中, 以此为原料得到的HTCC的红外光谱图中, 1600 cm^-1处氨基的吸收峰消失, 新出现了1481 cm^-1处— N⁺(CH₃)₃的较强弯曲振动吸收峰^[8]。 氯乙酰化以后, 在CAHTCC 的红外谱图中, 新出现了1730 cm^-1处的谱峰, 归属为羰基的特征峰^[9]。 同时, 在781 cm^-1处新出现的峰归属为C— Cl键的特征吸收峰。 证明氯乙酰化反应发生。 比较而言, 壳聚糖结构中, C₂— NH₂的活性最强, C₆— OH, C₃— OH活性相对较低, 其中C₃— OH又由于空间位阻比较大, 因此, C₆— OH化学活性大于 C3—OH10, 此处, 因为— NH₂已大部分被ETA接枝, 故氯乙酰化反应主要应该发生在C₆— OH。 在壳聚糖双季铵盐(PAHTCC)的红外光谱图中, 781 cm^-1处C— Cl键的吸收峰消失, 说明C— Cl键与吡啶发生了取代反应, 新出现吡啶环的特征吸收峰不明显^[11]。 分析原因应该是在本反应条件下, 氯乙酰化取代度较小, 吡啶取代氯以后, 谱峰较小。

图1

Fig.1

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	图1 壳聚糖、HTCC、CAHTCC和PAHTCC的红外光谱图Fig.1 FT-IR spectra of chitosan, HTCC, CAHTCC and PAHTCC

为进一步确定产物结构, 对产物进行了¹³C NMR 光谱测定, 由图2可见, 除了壳聚糖的骨架峰, 壳聚糖衍生物HTCC、CAHTCC及PAHTCC的谱图中均在δ 47.2处出现了一强峰, 归属为— N⁺(CH₃)₃的碳峰, CAHTCC与HTCC谱图比较多出了δ 166.9处 碳峰和δ 40.5处— CH₂Cl结构中的亚甲基碳峰, 吡啶取代氯以后, 在PAHTCC的谱图中 碳峰移动到δ 171.2处 ^[12], 此前— CH₂Cl结构中的亚甲基碳峰移动到δ 61.4附近, 与壳聚糖骨架峰发生了叠加, 同时, 在δ 146.0、128.5和148.2处的峰为吡啶环的碳峰^[13]。 以上谱图表明, 壳聚糖各级衍生物合成成功。

图 2

Fig.2

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	图 2 HTCC、CAHTCC和PAHTCC的13C NMR光谱图Fig.2 13C NMR spectra of HTCC、CAHTCC and PAHTCC

根据元素分析得出产品取代度结果如表1所示。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 HTCC、CAHTCC和PAHTCC的产率及取代度 Table 1 The yield and substitution degree of HTCC, CAHTCC and PAHTCC Samples Yield/%a Substitution degree/% Solubility in neutral aqueous solutionb Chitosan — — × HTCC 86.5 73.6 √ CAHTCC 75.3 40.8 √ PAHTCC 70.7 35.3 √ a.The yield of HTCCis the mass ratio of HTCC and chitosan, the yield of CAHTCC is the mass ratio of CAHTCC and HTCC, the yield of PAHTCC is the mass ratio of PAHTCC and CAHTCC; b.the solubility in neutral aqueous solution is tested at 25 ℃. “ × ” the solubility is less than 25%, “ √ ” the solubility is more than 25%; “ -” no corresponding project..

表 1 HTCC、CAHTCC和PAHTCC的产率及取代度 Table 1 The yield and substitution degree of HTCC, CAHTCC and PAHTCC

图3、图4、图5分别为壳聚糖、HTCC、CAHTCC、PAHTCC对· OH、· O2-、DPPH自由基的清除活性图。 可见, 对于3种自由基清除率均随样品浓度的增加而逐渐提高, 清除率相对大小均符合PAHTCC> HTCC> CAHTCC> 壳聚糖。 分析原因为HTCC、CAHTCC、PAHTCC 3种壳聚糖衍生物中均有季铵盐结构, 聚阳离子性较壳聚糖增强, 氯乙酰化之后, CAHTCC活性较HTCC弱, 经分析, 原因应该是氯乙酰基接入HTCC后, 使HTCC分子中活泼羟基和氨基数目下降所致^[14]。 而吡啶取代CAHTCC中的氯得到的PAHTCC, 其抗氧化能力明显增强, 原因应该是在PAHTCC的分子结构中, 存在双季铵盐结构, 使得分子聚阳离子性增强, 据文献报道, 壳聚糖衍生物的抗氧化能力与其分子本身的正电性强弱有着极大的关系^[14]。

图 3

Fig.3

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	图 3 壳聚糖(a)、HTCC(b)、CAHTCC(c)和PAHTCC(d)对羟自由基的清除率Fig.3 HO( scavenging activity of chitosan(a), HTCC(b), CAHTCC(c) and PAHTCC(d)

图4

Fig.4

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	图4 壳聚糖(a)、HTCC(b)、CAHTCC(c)和PAHTCC(d)对超氧阴离子自由基的清除率Fig.4 · O2- scavenging activity of chitosan(a), HTCC(b), CAHTCC(c) and PAHTCC(d)

图5

Fig.5

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	图5 壳聚糖(a)、HTCC(b)、CAHTCC(c)和PAHTCC(d)对DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH scavenging activity of chitosan(a), HTCC(b), CAHTCC(c) and PAHTCC(d)