重组大肠杆菌 E coli BL21/pET28a-LhDMDH菌株^[9]由本研究室构建和保藏,用于 D-扁桃酸脱氢酶的生产;重组大肠杆菌 E.coli BL21/pET28a-EsleuDH菌株^[14]由华东理工大学许建和教授馈赠,用于生产 L-亮氨酸脱氢酶; D-扁桃酸、苯乙酮酸、 D-苯甘氨酸和 L-苯甘氨酸均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,均为分析纯试剂;异丙基硫代- β-D-半乳糖苷(Isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)购自于上海生工生物工程有限公司;氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD⁺)和还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)购自于深圳邦泰生物工程有限公司;甲醇购自于天津科密欧化学试剂有限公司,色谱纯;其它试剂均为国产或进口的分析纯产品。 LB(Luria-Bertani,溶菌肉汤)培养基:1%胰蛋白胨、1%氯化钠和0.5%酵母提取物,自然的pH值,121 ℃灭菌20 min,主要用于 E.coli的培养。

EC 2006型高效液相色谱系统(HPLC,大连依利特分析仪器有限公司);Thermo Hypersil C18柱(美国Thermo Scientific公司),用于产物的定性和定量分析;Chirobiotic T手性柱(大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)用于产物的手性分析;Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL型高分辨质谱仪(美国Thermo Scientific公司)。

用超纯水将 L-苯甘氨酸分别配成1.0~3.0 mmol/L的溶液(以0.5 mmol/L为间隔),然后分别取20 μL进行HPLC分析,获得各浓度下样品的峰面积,并进行线性拟合获得回归方程及相关系数。 HPLC色谱柱为Thermo Hypersil C18柱,检测波长为215 nm,柱温30 ℃,流动相为甲醇/水(体积比为20:80),流速为1 mL/min。 产物以同样的条件进行HPLC分析,根据测得的峰面积可依回归方程计算出相应的样品浓度。 在此条件下, L-苯甘氨酸的保留时间约为3.43 min,将 L-苯甘氨酸不同浓度浓度值对相应的峰面积进行线性拟合,获得 L-苯甘氨酸的标准曲线,得出 L-苯甘氨酸浓度对应的回归方程为 y=0.0003 x-0.3307,相关系数为0.9998。

先参照1.2节中的方法对产物进行普通C18柱的HPLC分析。 然后,利用Chirobiotic T手性柱对产物及 L-苯甘氨酸标准品进行HPLC分析,流动相为甲醇/水/三氟乙酸(体积比为20:80:0.1),流速为0.5 mL/min,检测波长为254 nm,柱温30 ℃,依此来计算产物中 L-苯甘氨酸的对映体过量( e.e.)值。 根据在相同分析条件下,产物在普通Thermo Hypersil C18柱以及Chirobiotic T手性柱中的保留时间,与 L-苯甘氨酸标准品的保留时间是否一致,来对产物进行初步的定性分析。 最后,对底物和产物进行高分辨质谱分析,基于质荷比对其进行定性分析。

采用低诱导剂浓度及低温策略对重组大肠杆菌进行诱导表达^[18],分别将 E.coli BL21/pET28a-LhDMDH和 E.coli BL21/pET28a-EsLeuDH菌株接种至含卡拉霉素的4 mL LB液体培养基,37 ℃、200 r/min的条件下培养14 h,再以2%接种量转接至100 mL新鲜的无抗LB液体培养基,37 ℃、200 r/min培养2.5 h,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,16 ℃、200 r/min诱导培养20 h,8000 r/min、4 ℃,离心5 min,收集菌体,加入10 mL裂解缓冲液,重悬,然后进行超声破碎,然后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及酶活性分析^[2,9,14]。

在50 mL的具塞三角瓶中构建10 mL的反应体系,10 mL反应液中包含500 mmol/L NH₄Cl-NH₃·H₂O(pH=9.5)缓冲液、100~400 mmol/L的 D-扁桃酸、5.0~10 kU/L的LhDMDH、5.0~10 kU/L的EsLeuDH、0~10 mmol/L的NAD⁺,混匀后于30 ℃、180 r/min,反应12 h,每隔2 h,取样1次,经离心后用HPLC法测定产物的得率。

分别将重组大肠杆菌 E.coli BL21/pET28a-LhDMDH和 E.coli BL21/ pET28a-EsLeuDH菌株按照1.4节中的方法进行诱导表达,将100 mL诱导后的菌液冷冻离心收集菌体,经10 mL裂解缓冲液重悬,再超声破碎后进行酶活性及蛋白分析。 SDS-PAGE的结果如图2所示, E.coli BL21/pET28a-LhDMDH和 E.coli BL21/ pET28a-EsLeuDH的表达产物分别在约3.8×10⁴和4.0×10⁴处均有明显的特异性条带,结果表明这两种菌株在IPTG的诱导下均成功表达出目的蛋白。 D-扁桃酸脱氢酶和 L-亮氨酸脱氢酶酶活性分析的结果显示,在30℃、pH=9.5(NH₄Cl-NH₃·H₂O缓冲环境)的测定条件下, D-扁桃酸脱氢酶对 D-扁桃酸的氧化活性为250 U/mL,而 L-亮氨酸脱氢酶对苯乙酮酸的还原活性为54 U/mL,酶的表达水平与文献报道的基本一致^[14]。

图2

Fig.2

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	图2 重组大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE分析图谱Fig.2 The SDS-PAGE analysis for the expression products of recombinant E.coli strains M.Page Ruler Prestained Protein Ladder; 1.expression products of E.coli BL21/pET28a-LhDMDH; 2.expression products of E.coli BL21/pET28a-EsLeuDH

2.2.1 加酶量对 L-苯甘氨酸得率的影响

参照1.5节中的方法,首先考察了不同加酶量对 L-苯甘氨酸得率的影响。 由于在该级联催化反应中, D-扁桃酸脱氢酶和 L-亮氨酸脱氢酶的辅酶恰好可以实现反应内部的辅酶循环^[2],在本研究中将两种酶的添加比例暂定为1:1。 在100 mmol/L底物、0.1 mmol/L NAD⁺和0.5 mol/L NH₄⁺的条件下,考察了各酶加酶量为5.0、6.5、7.5和10 kU/L反应液时的转化效率,反应进程曲线如图3所示。 由图3可知,加酶量越大,反应速率越快。在已考察的4种条件下,当加酶量为10 kU/L时,反应速率最快,反应进行到第4 h时产物得率接近100%。 而加酶量为6.5 kU/L时,反应进程相对较缓,在第10 h时产物得率可达98%,综合考虑酶的使用成本及生产效率,选择将加酶量6.5 kU/L作为下一步继续考察的条件。

图3

Fig.3

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	图3 不同加酶量下的反应进程曲线Fig.3 The reaction process curves at different enzyme addition amounts

2.2.2 辅酶添加量对 L-苯甘氨酸得率的影响

辅酶是氧化还原酶的重要辅因子,在氧化还原反应中起关键的作用^[2]。 过低的辅酶浓度会降低氧化还原反应的效率,过高的辅酶浓度又会增加辅酶的使用成本,有时甚至还会产生辅酶抑制效应^[16]。 在100 mmol/L底物、6.5 kU/L加酶量和0.5 mol/L NH₄⁺的条件下,分别考察了0、0.01、0.1、1和10 mmol/L NAD⁺下 L-苯甘氨酸的得率,结果如图4所示。 结果表明,NAD⁺的浓度对产物得率有较大影响,0.1 mmol/L的NAD⁺是一个临界点,当添加量低于0.1 mmol/L时,由于反应体系中含有的辅酶浓度太低,影响到了氧化还原反应中电子的传递速率,减慢了整个反应的速率;而当添加量超过0.1 mmol/L时,反应的速率提升并不明显,表明此时辅酶浓度已经完全满足氧化还原反应的需求,过多的添加辅酶只会增加成本,不会提高生产效率。 而在没有额外添加NAD⁺的条件下, L-苯甘氨酸的得率也能达到22%,表明在此条件下级联反应也能进行,这可能归因于加入的酶液中含微量的由大肠杆菌产生的NAD⁺,而低浓度的辅酶能够维持氧化还原反应,但反应速率较低。 这一现象与我们前期研究中利用全细胞催化技术,在无辅酶添加条件下,以扁桃酸为底物进行苯乙酮酸生物合成的案例保持一致^[9],也为后续利用全细胞催化合成 L-苯甘氨酸奠定了理论基础。

图4

Fig.4

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	图4 不同NAD+添加量下 L-苯甘氨酸的得率Fig.4 The yield of L-phenylglycine at different NAD+ concentrations

2.2.3 NH₄⁺浓度对 L-苯甘氨酸得率的影响

NH₄⁺是中间产物苯乙酮酸胺化还原的重要辅底物,其浓度对终产物的形成有重要的影响^[2,5]。 为了获得最佳的NH₄⁺浓度,在100 mmol/L底物、0.1 mmol/L NAD⁺和6.5 kU/L加酶的条件下,考察了0.1、0.2、0.5、1和2 mol/L NH₄⁺对产物得率的影响,结果如图5所示。 在一定范围内,提高NH₄⁺浓度有利于提高产物的得率,这可能归因于高浓度的NH₄⁺能促进中间产物的胺化还原,有利于产物的生成。 当NH₄⁺浓度达到5倍底物浓度时,产物得率可达98%,且此后得率随NH₄⁺浓度增加的趋势已不明显。 因此,基于节约NH₄⁺的使用及降低后续产物分离成本的考虑,将5倍底物浓度的NH₄⁺浓度定为最佳的浓度。

图5

Fig.5

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	图5 不同NH4+浓度下 L-苯甘氨酸的得率Fig.5 The yield of L-phenylglycine at different NH4+ concentrations

2.2.4 底物浓度对 L-苯甘氨酸得率的影响

提高反应体系中的底物浓度能够提高产物的浓度及时空得率,可以降低后续产物分离的成本,提高设备的利用率^[2,14]。 在0.5 mol/L NH₄⁺、0.1 mmol/L NAD⁺和6.5 kU/L加酶量的条件下,考察了100、200、300和400 mmol/L底物浓度对产物得率的影响,结果如图6所示。 结果表明,在底物浓度为200 mmol/L时,产物得率也能达到98%左右;当底物浓度达到300 mmol/L时,得率会显著下降。 此外,当底物浓度超过200 mmol/L时,反应过程中会出现白色的絮状物,将絮状物离心收集复溶于超纯水,经HPLC检测,发现该物质与中间产物苯乙酮酸的保留时间一致。 这一现象表明,过高的底物浓度会使中间产物的生成速率过快,中间产物来不及进一步转化为 L-苯甘氨酸;同时,由于苯乙酮酸的极性低于 D-扁桃酸,故会以沉淀的形式析出。 在以后的研究中,可以采用底物流加(Substrate flow)的工艺,逐渐提高底物浓度,以获得更高的时空得率。经过对催化条件的初步优化,200 mmol/L的 D-扁桃酸在6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD⁺、0.5 mol/L NH₄⁺的条件下,30 ℃,反应12 h后,产物的得率和 e.e.值分别可达98%和99%以上,转化率明显高于前人的报道^[2]。 另外,由于该研究所选用的 D-扁桃酸脱氢酶的活性更高^[2,19],使酶的使用成本更低,具有更高的技术经济性。

图6

Fig.6

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	图6 不同底物浓度下 L-苯甘氨酸得率比较Fig.6 Comparison of L-phenylglycine yield at different concentrations of R-mandelic acid

将反应产物经过离心及硅胶柱纯化后,按照1.3节中的方法进行普通C18柱的HPLC分析,产物保留时间约为3.4 min,与相同分析条件下 L-苯甘氨酸的保留时间一致。 将底物及纯化的产物进行高分辨质谱分析,结果如图7所示。 在图7A中,由质荷比可以推出物质的分子式可能为C₈H₈O₃Na⁺(M+Na)⁺,表明该物质是C₈H₈O₃(扁桃酸)结合了一个Na⁺;在图7B中,由质荷比可以推出物质的分子式可能为C₈H₁₀NO₂₊(M+H)⁺,表明该物质是C₈H₉NO₂(苯甘氨酸)结合了一个H⁺。

图7

Fig.7

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	图7 底物和产物的高分辨质谱分析Fig.7 The high resolution mass spectrometry analysis of the substrate(A) and the product(B)

用Chirobiotic T手性柱参照1.3节中的方法对 L-苯甘氨酸、 D-苯甘氨酸及产物进行HPLC分析, L-苯甘氨酸和 D-苯甘氨酸的保留时间分别约为7.4和8.9 min,大部分产物的保留时间在7.4 min左右,在8.9 min左右的峰面积较小。结合普通C18柱HPLC分析及高分辨质谱的分析结果,进一步表明该级联反应的终产物主要为 L-苯甘氨酸,且其 e.e.值大于99%,该级联反应具有较高的对映体选择性。