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夏颖, 夏菁, 崔洪燕, 钱明, 张留伟, 陈麒先, 王静云. 同源细胞膜包覆智能释药纳米粒用于肝癌靶向治疗[J]. 应用化学, 37(1): 69-79
XIA Ying, XIA Jing, CUI Hongyan, et al. Homologous Cell Membrane Coated Smart Drug-Release Nanoparticles for Targeted Hepatocellular Carcinoma Therapy[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 37(1): 69-79  
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同源细胞膜包覆智能释药纳米粒用于肝癌靶向治疗
夏颖, 夏菁, 崔洪燕, 钱明, 张留伟, 陈麒先, 王静云*
大连理工大学生物工程学院 辽宁 大连 116024
通讯联系人:王静云,教授; Tel/Fax:0411-84706355; E-mail:wangjingyun67@dlut.edu.cn; 研究方向:用于肿瘤治疗的诊疗一体化多功能纳米材料;与疾病相关的活细胞内离子、活性分子的荧光可视化
收稿日期:2019-04-22 修回日期:2019-04-22 接受日期:2019-04-22
基金:国家自然科学基金项目(21878041)资助;
摘要

近年来,纳米药物递送系统在癌症治疗方面的应用受到广泛关注。 传统的纳米药物递送系统存在生物相容性差、靶向性缺乏、在肿瘤部位释药缓慢等问题。 本文设计制备了一种同源细胞膜(M)包覆、癌细胞还原微环境控制释药的脂质体纳米粒子(命名为P-ss-G/D/Sf@M)来递送肝癌治疗药物索拉非尼(Sf)用于肝癌的靶向治疗。 利用薄膜水化法结合静电吸附及过膜挤压法制备包覆细胞膜的空白(P-ss-G/D@M)及载药(P-ss-G/D/Sf@M)纳米粒子。 P-ss-G/D/Sf@M对Sf的载药量为7.2%,包封率为79.9%。 体外释药结果显示,P-ss-G/D/Sf@M在还原条件下会加快药物的释放,48 h时药物释放量达到65%以上,较非还原条件下释药量提高了25%。 体外细胞实验结果证明,包覆肝癌细胞膜的纳米粒子更易被肝癌细胞摄取,表现了对肝癌细胞的靶向性,同时在肿瘤细胞高浓度谷胱甘肽(GSH)还原环境作用下,纳米粒子中的二硫键断裂,迅速释放药物,与非还原敏感载药纳米粒子相比,显著抑制肝癌细胞生长,提高细胞凋亡率。 因此,本文制备的同源细胞膜包覆的智能释药载体有可能用于今后的癌症治疗中。

关键词: 细胞膜靶向; 谷胱甘肽响应; 脂质体; 聚乳酸-羟基乙酸; 索拉非尼
中图分类号:O648 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2020)01-0069-11
Homologous Cell Membrane Coated Smart Drug-Release Nanoparticles for Targeted Hepatocellular Carcinoma Therapy
XIA Ying, XIA Jing, CUI Hongyan, QIAN Ming, ZHANG Liuwei, CHEN Qixian, WANG Jingyun*
School of Bioengineering,Dalian University of Technology,Dalian,Liaoning 116024,China
Corresponding author:WANG Jingyun, professor; Tel/Fax:0411-84706355; E-mail:wangjingyun67@dlut.edu.cn; Research interests:multi-functional nanomaterials for diagnosis and treatment of tumors; visualization of disease-associated ions and active molecules in living cells by fluorescence
Received:2019-04-22 Revised:2019-04-22 Accepted:2019-04-22
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21878041);
Abstract

Nanoparticle drug delivery system has played an important role in enhancing the efficacy of traditional chemotherapy drugs in recent years. However, the main challenges faced by conventional nanoparticle include poor biocompatibility, low specific targeting and slow drug release in target sites. In this work, we fabricated an efficient hepatocellular carcinoma-targeting liposome system functionalized with a redox-cleavable and homologous cell membrane(M)-targeting. The blank (P-ss-G/D@M) and drug-loaded (P-ss-G/D/Sf@M) nanoparticles coated with cell membrane were prepared by thin-film hydration method combined with electrostatic adsorption and membrane extrusion. The drug-loading amount of sorafenib was 7.2%, and the encapsulation efficiency was 79.9%. The results of in vitro drug release showed that P-ss-G/D/Sf@M accelerated drug release under reducing conditions, and the drug release rate was more than 65% at 48 hours, which was 25% higher than that under non-reducing conditions. In vitro study demonstrated that nanoparticles coated with hepatoma cell membrane were more easily taken into hepatoma cells, showing the targeting of hepatocellular carcinoma. At the same time, the disulfide bonds in the nanoparticles broke and drugs were rapidly released under the high concentration of glutathione (GSH) in the tumor cells. Compared with non-reducing sensitive drug-loaded nanoparticles, P-ss-G/D/Sf@M could significantly inhibit the growth of hepatoma cells (Hep-G2) and increase the apoptosis rate of hepatoma cells. Therefore, the homologous cell membrane-coated smart drug delivery carrier prepared herein is likely to be used to treat hepatocellular carcinoma in future.

Keyword: cell membrane targeting; glutathione-response; liposomes; poly(lactic- co-glycolic acid); sorafenib

原发性肝癌是全球最常见的癌症之一,严重危害人类的健康。 目前,化疗是治疗肝癌最有效的方法。 在化疗药物中,索拉非尼(Sf)作为一种由美国食品药物监督管理局(FDA)批准上市的多激酶抑制剂,是晚期肝癌的一线治疗药物[1,2]。 然而, 由于Sf具有溶解度差、生物利用度低以及显著的毒副作用等缺陷,因此在肝癌治疗的临床应用中受到了严重的限制。 近些年,纳米药物载体的兴起为改善抗肿瘤药物的固有缺陷带来了新的希望,利用纳米载体包覆疏水性药物,可有效增加其溶解性和抗肿瘤作用[3,4],其中脂质体作为一种最常用的纳米药物载体,具有良好的生物相容性,优异的生物可降解性以及较低的毒性和免疫原性[5]。 但是传统脂质体在实际应用中存在一些局限性,如肿瘤靶向性差和细胞内药物释放不足等。 因此,如何同时实现药物在肿瘤部位的聚集以及有效释放是开发高效抗肿瘤纳米药物的两大核心问题。

采用主动靶向递送的策略是提高纳米粒子在肿瘤部位富集的有效策略之一。目前常用的主动靶向策略是通过在纳米粒子表面修饰肿瘤特异性的靶向配体,如半乳糖、乳糖、叶酸、抗体或多肽等,利用靶向配体与肿瘤细胞表面过表达的相应受体发生特异性的亲和作用,从而介导纳米载体进入肿瘤细胞[6,7]。 但是,这种配体-受体结合作用介导的主动靶向策略在很大程度上受到靶向部位受体密度的限制,且通过化学方法修饰纳米载体使制备过程复杂化,可能导致潜在的不可控因素如免疫原性等的发生,阻碍了其实际应用[8]。 近年来,由于仿生学的迅速发展,细胞膜(M)仿生纳米粒子引起了人们的广泛关注。 所谓的细胞膜仿生纳米粒子就是从天然细胞中收集细胞膜,将其包覆在合成的纳米粒子表面,得到的仿生纳米粒子既具有合成纳米材料高度可调的理化性质,同时又具有宿主细胞膜高度复杂的生物学功能,如配体识别、靶向、长血液循环和免疫逃逸等[9,10,11],在纳米药物递送方面显示出巨大的应用前景。 研究表明,肿瘤细胞表面特异性蛋白( N-钙粘蛋白、整合素和上皮细胞粘附分子(EpCAM)等)具有与同源细胞相互识别和粘附作用[12,13],因此,将癌细胞膜包覆在纳米粒子表面,利用癌细胞膜表面膜蛋白的这种相互识别和粘附作用,将药物主动靶向到肿瘤部位,从而实现药物的富集和有效治疗[14,15,16,17,18]。

为了进一步实现被包封药物在肿瘤部位迅速释放,可以引入响应肿瘤微环境的敏感键,使纳米粒子具有触发式释放药物的能力[19,20]。 其中基于二硫键连接的纳米药物递送系统可以利用肿瘤细胞内外谷胱甘肽(GSH)浓度的巨大差异来实现药物在肿瘤细胞内的快速释放,从而大大提高了药物的生物利用度[21,22]。 二硫键在血液循环及肿瘤细胞外环境(GSH浓度220 μmol/L)可稳定存在,但当纳米粒子进入肿瘤细胞(GSH浓度210 mmol/L)后,在细胞内高浓度GSH的作用下二硫键断裂,载体结构破坏,使得药物快速释放,增强对癌症的治疗效果[23,24,25]。

在此,我们设计合成了一种由肝癌细胞膜包覆的氧化还原敏感脂质体纳米粒,利用肝癌细胞膜的靶向作用准确到达肿瘤部位,并在肿瘤细胞内高浓度GSH的作用下迅速断裂,释放所载药物(图1)。 首先以生物可降解高分子聚乳酸-羟基乙酸(PLGA,P)作为疏水端,带正电的甜菜碱(G)作为亲水端,以含二硫键的胱胺二盐酸盐作为桥链将二者连接,合成具有氧化还原敏感的两亲性聚合物(P-ss-G)。 以带正电的氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol,D)作为辅助脂质体材料,将其与合成的氧化还原敏感的P-ss-G聚合物混合制备氧化还原敏感脂质体纳米粒,同时疏水性药物索拉非尼(Sf)包覆在形成的脂质体纳米粒的疏水部位获得载药纳米粒(P-ss-G/D/Sf),进一步通过静电吸附及过膜挤压法包覆细胞膜,最终合成细胞膜包覆的氧化还原敏感脂质体纳米粒(P-ss-G/D/Sf@M)。 用纳米粒径及电位分析仪、透射电子显微镜(TEM)等对其粒径大小和分布进行表征,利用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对纳米粒表面蛋白进行表征,通过模拟体内还原条件,检测P-ss-G/D/Sf@M的体外释药情况,并在细胞水平上研究P-ss-G/D/Sf@M对肝癌Hep-G2细胞的靶向性及细胞内还原响应释药性能,最后用体外抗肿瘤实验验证了空白纳米粒P-ss-G/D@M的生物相容性以及载药纳米粒P-ss-G/D/Sf@M 对肝癌细胞的增殖抑制活性及诱导凋亡能力。

图1 同源细胞膜靶向的还原响应释药纳米递送系统示意图Fig.1 Schematic illustration of homologous membrane-targeted reduction-responsive release drug delivery system(P-ss-G/D/Sf@M nanoparticles)

1 实验部分
1.1 试剂和仪器

聚乳酸-羟基乙酸(PLGA n(乳酸): n(羟基乙酸)=75:25, Mw=1000)购自济南岱罡生物有限公司;氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)购自上海爱必信生物科技有限公司;胱胺二盐酸盐(Cd,97%)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC,98%)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,98%)、甜菜碱(G,99%)、谷胱甘肽(GSH,98%)、己二胺(Hd,分析纯)、二甲基亚砜(DMSO,分析纯)及磷酸盐缓冲液(PBS)均购自阿拉丁试剂有限公司;索拉菲尼(Sf,99%)购自大连美伦生物有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和Hoechst 33342购自大连辰钰生物科技有限公司;膜蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;胎牛血清(FBS)、DMEM细胞培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;人肝癌细胞(Hep-G2)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人宫颈癌细胞(HeLa)细胞系购自中科院上海细胞所细胞库。

Bruker Avance II 400型核磁共振氢谱仪(NMR,瑞士布鲁克公司);Nicolet 200 SXV-1型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR,美国Nicolet公司);Zetasizer Nano ZS90型纳米粒度及电位分析仪(英国马尔文公司);JASCO V-560型紫外/可见光分光光度仪(UV-Vis,安捷伦科技有限公司);FV-1000型激光共聚焦显微镜(CLSM,日本Olympus公司);SpectraMax M2e型酶标仪(美国Molecular Devices公司);FACSCanto型流式细胞分析仪(美国BD医疗公司);Tecnai G2型透射电子显微镜(TEM,FEI香港有限公司)。

1.2 载体材料的合成及表征

含二硫键载体材料P-ss-G的合成 合成路线如Scheme 1所示。 PLGA(P)(0.5 g,0.5 mmol/L)溶于DMSO(4 mL)中,加入EDC(115 mg,0.6 mmol/L)和NHS(69 mg,0.6 mmol/L),室温下持续搅拌4 h活化PLGA的羧基。 将活化好的反应液逐滴滴加在胱胺二盐酸盐(Cd)(225 mg,1 mmol/L)的DMSO(4 mL)溶液中,37 ℃,继续搅拌24 h。 反应结束后,将反应产物在水中沉淀,后冷冻干燥得到P-Cd。 将甜菜碱(G)(135 mg,1 mmol/L)溶于 V(DMSO): V(水)=10:1(4 mL)的混合溶液中,加入EDC(230 mg,1.2 mmol/L)和NHS(138 mg,1.2 mmol/L),室温下持续搅拌4 h以活化甜菜碱的羧基。 将第1步产物(P-Cd)溶于DMSO(4 mL),加入到活化好的反应液中,37 ℃,反应72 h,将反应产物在水中沉淀,冷冻干燥得到P-ss-G载体材料,置于 -20 ℃冰箱中保存备用。 同时,按上述方法利用己二胺(Hd)代替胱胺二盐酸盐合成不含二硫键的对照组P-G。 各产物的结构利用1H NMR(DMSO- d6 为溶剂,TMS为内标)及FT-IR表征。

Scheme 1 The synthesis routes of P-ss-G and P-G

1.3 未包膜的空白纳米粒子(P-ss-G/D)及载药纳米粒子(P-ss-G/D/Sf)的制备

利用薄膜水化法制备纳米粒子,将 m(P-ss-G): m(DC-Chol)=15:1的样品溶于无水乙醇,在45 ℃下减压旋转蒸发,直至形成均匀的薄膜,加入5 mL去离子水,探头超声2 min,即获得P-ss-G/D纳米粒子溶液。P-ss-G/D和Sf按载药比10:1溶于无水乙醇中,按上述方法制备载药纳米粒子(P-ss-G/D/Sf)。

1.4 包覆细胞膜的空白纳米粒子(P-ss-G/D@M)及载药纳米粒子(P-ss-G/D/Sf@M)的制备

细胞膜提取 按膜蛋白提取试剂盒说明步骤进行,培养各种细胞(Hep-G2、COS-7、MCF-7和HeLa细胞),收集并悬浮在膜蛋白提取试剂A液和低渗裂解缓冲液PMSF溶液中,冰浴1015 min,匀浆破碎细胞,4 ℃,700 g离心10 min,收集上清,接着4 ℃,14000 g离心30 min,收集沉淀,冻干干燥,称重,储存于-80 ℃待用。

P-ss-G/D@M、P-ss-G/D/Sf@M的制备 将之前制备好的P-ss-G/D和P-ss-G/D/Sf纳米粒子与相同质量的细胞膜混合,室温孵育10 min后,分别用800、450和220 nm水系滤膜挤压后得到P-ss-G/D@M和P-G/D/Sf@M。 纳米粒子需现配现用。

1.5 纳米粒子的表征

利用DLS测定纳米粒子的粒径、多分散指数(PDI)及电势,利用TEM观察其形态,利用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对纳米粒表面蛋白进行表征。

1.6 载药量及包封率测定

载药纳米粒子的载药量(DL)和包封率(EE)通过标准曲线法测定[26]。将载药纳米粒子1000 r/min离心5 min除去未包封的Sf,取上清加入无水乙醇( V(无水乙醇): V(水)=2:1)中,利用紫外分光光度计检测其在265 nm处的吸光值,并用相同浓度的空白纳米粒子作为空白对照,然后将测得的吸光值代入到Sf浓度-吸光度标准曲线公式中,计算出Sf的含量。 利用如下式(1)和(2)计算载药量(DL)和包封率(EE):

DL=m1m2×100%(1)

EE=m1m3×100%(2)

式中, m1为载药纳米粒子中Sf质量(mg), m2为载药纳米粒子总质量(mg), m3为Sf初始添加总质量(mg)。

1.7 体外释药行为

采用低速离心法检测P-ss-G/D/Sf@M纳米粒子的体外释药情况。将制备好的P-ss-G/D/Sf@M和P-G/D/Sf@M纳米粒子置于1.5 mL离心管中,分别设置P-ss-G/D/Sf@M+10 mmol/L GSH、P-ss-G/D/Sf@M+0 mmol/L GSH、P-G/D/Sf@M+10 mmol/L GSH和P-G/D/Sf@M+0 mmol/L GSH组,将离心管置于100 r/min的37 ℃恒温摇床,并在预设时间点取出离心管,1000 r/min离心5 min,取上清液用紫外分光光度计在265 nm处检测Sf含量,其中以相同条件的未载药纳米粒子作为空白参比。

1.8 细胞对纳米粒子的摄取实验

为了研究Hep-G2和正常细胞COS-7对纳米粒子的摄取情况及药物分布,选取能发射红色荧光的疏水性药物阿霉素(DOX)代替索拉非尼作为模型药物,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对细胞摄取纳米粒子的情况进行分析。

首先利用激光共聚焦显微镜对纳米粒子的摄取情况进行定性分析。 将Hep-G2细胞和COS-7细胞接种于共聚焦培养皿中培养24 h,小心吸去培养基,用阿霉素终浓度为4 μmol/L的P-ss-G/D/DOX@M及P-G/D/DOX@M纳米粒子处理4 h,加入含有10 μg/mL Hoechst 33342的培养基染色15 min,PBS缓冲液清洗2次去除多余的染料后,利用激光共聚焦显微镜进行观察。 利用流式细胞术对纳米粒子的摄取情况进行定量分析:按上述步骤培养细胞并加药处理4 h后,PBS清洗2次以去除未进入细胞的DOX,消化收集细胞,用流式细胞仪进行定量分析。

1.9 载药纳米粒子的体外抗肝癌活性

分别利用MTT细胞毒性及AnnexinV-PI细胞凋亡分析法考察了载药纳米粒子的体外抗肝癌活性。

MTT分析步骤为:将Hep-G2细胞接种于96孔板中培养1224 h后,吸去培养基,更换成含有不同浓度的空白载体P-ss-G/D、P-ss-G/D@M(Hep-G2)、P -G/D及P-G/D@M(Hep-G2)和载药载体P-ss-G/D/Sf@M(Hep-G2)、P-ss-G/D/Sf@M(COS-7)及P- G/D/Sf@M(Hep-G2)的培养基后培养24 h,PBS清洗2次,加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL),继续放入培养箱中培养35 h,小心吸去孔内MTT溶液,更换成100 μL DMSO溶液以溶解蓝紫色甲臢结晶,摇晃均匀后,置于酶标仪下,检测其在570和630 nm波长下的吸光度值(OD),通过式(3)计算细胞存活率,其中,以空白细胞作为空白对照。

细胞存活率/%=实验组(OD570nm-OD630nm)空白组(OD570nm-OD630nm)×100%(3)

AnnexinV-PI细胞凋亡实验 将Hep-G2细胞接种于6孔板中培养1224 h后,吸去培养基,更换成含有Sf终浓度为6 μmol/L的P-ss-G/D/ Sf@M(Hep-G2)、P-ss-G/D/Sf@M(COS-7)和P-G/D/Sf@M(Hep-G2)的培养基后培养6 h,用PBS清洗2次,加入胰蛋白酶消化,加入培养基吹散后,3000 r/min离心3 min,收集细胞,再用PBS清洗2次,加入300 μL Binding Buffer,轻柔地吹散细胞,之后加入1 μL Annexin V(AV),混匀后加入0.5 μL 碘化丙啶(PI),避光孵育20 min,用流式细胞仪进行检测,同时以不加AnnexinV及PI的样品作为阴性对照。

1.10 统计学分析

数据均以mean±SD表示,采用单因素方差分析(AVOVA)进行统计分析,并用Tukey's test进行多重比较, P<0.05认为在统计学上有显著差异(采用“*”表示), P<0.01认为在统计学上有极显著差异(采用“**”表示)。

2 结果与讨论
2.1 载体材料的合成与表征

本文中合成了一种含有二硫键的阳离子两亲性聚合物P-ss-G(Scheme 1),其中利用可降解的高分子PLGA作为疏水端,带正电荷的甜菜碱作为亲水端。 其核磁共振氢谱图(图2)结果表示,相对于原料PLGA,P-ss-G在 δ 2.53.0出现了胱胺上的亚甲基(N—CH2—CH2—S)质子峰, δ 3.3附近出现了甜菜碱上的甲基峰(N—CH3), δ 4.5处出现了甜菜碱上的亚甲基(N—CH2—C=O)质子峰, δ 8.0处出现了酰胺键中NH的质子峰,且原来PLGA上 δ 13.25左右的羧基上的OH峰消失,说明P-ss-G聚合物已经成功合成。 进一步通过FT-IR观察到,相对于PLGA,P-Cd和P-ss-G在1533 cm-1处出现了酰胺NH的变形振动峰,也进一步说明载体材料已被成功合成。

图2 P-ss-G的核磁共振氢谱(A)和红外图谱(B)Fig.2 1H NMR(A) and FT-IR(B) spectra of P-ss-G

2.2 包覆细胞膜的纳米粒子的制备及表征

通过薄膜水化法制备纳米粒子,当 m(P-ss-G): m(DC-Chol)=15:1,未包细胞膜的纳米粒子粒径大约为118.2 nm,电势为48.7 mV(表1),将提取的细胞膜按质量比1:1与上述纳米粒子混合,通过静电相互作用及800、450和220 nm水系滤膜挤压后得到包细胞膜的纳米粒子(P-ss-G/D@M),包覆细胞膜后纳米粒子粒径从118.2 nm增加至140.2 nm(图3A),电势从48.7 mV变为-27.3 mV(图3B),这些结果表面,细胞膜已经成功包覆载纳米粒子表面。 TEM结果(图3C)显示,纳米粒子为球形,粒径与DLS测定结果相近。 通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验进一步验证细胞膜成功包载到纳米粒上,结果如图3D所示,未包覆细胞膜的纳米粒子(P-ss-G/D)没有蛋白条带出现,而包覆了肝癌细胞膜的纳米粒子(P-ss-G/D@M(Hep-G2))具有与肝癌细胞膜相似的蛋白条带出现,说明细胞膜已经成功包覆在纳米粒子表面,且在制备包膜纳米粒子的过程中,细胞膜表面的膜蛋白有较好的保留,从而使其能够具有同源细胞膜特有的生物学功能。 按 m(载体): m(Sf)=10:1制备载药纳米粒子,利用紫外分光光度计测定Sf在265 nm的吸光值,通过Sf浓度-吸光度标准曲线公式(图S1)计算其DL为7.2%,EE为79.9%(表1)。

图3 P-ss-G/D和P-ss-G/D@M的(A)粒径变化、(B)电位变化、(C)透射电子显微镜图和(D)SDS-PAGE凝胶电泳分析((I)P-ss-G/D、(II)Hep-G2细胞膜以及(III)P-ss-G/D@M(Hep-G2) )Fig.3 (A)Size, (B)Zeta potential, (C)TEM images of P-ss-G/D and P-ss-G/D@M, (D)SDS-PAGE analysis of (I)P-ss-G/D, (II)Hep-G2 cell membrane and (III)P-ss-G/D@M(Hep-G2)

表1 不同纳米粒子理化性质 Table 1 Physiochemical characterization of different nanoparticles
2.3 体外释药

为了验证P-ss-G/D/Sf@M纳米粒子的还原响应性释药情况,本文采用10 mmol/L GSH模拟体内还原条件,并以P-G/D/Sf@M作为对照,结果如图4所示,在10 mmol/L GSH的作用下,48 h时,P-ss-G/D/Sf@M载药纳米粒子Sf的累计释放量达到65%以上,在未加GSH的情况下,Sf的累计释放量则低于40%。 而对于不含二硫键的载药纳米粒子 P-G/D/Sf@M,GSH是否存在对于Sf的累计释放量几乎没有影响,其Sf的累计释放量均在40%左右,说明了P-ss-G/D/Sf@M纳米粒子具有明显的还原响应释药特性。

图4 P-ss-G/D/Sf@M和P-G/D/Sf@M在含有10 mmol/L GSH以及不含GSH的溶液中Sf的累积释放情况Fig.4 The drug release profiles of P-ss-G/D/Sf@M and P-G/D/Sf@M in absence or presence of 10 mmol/L GSH

2.4 包覆细胞膜纳米粒子对同源细胞的靶向性

为了验证P-ss-G/D@M纳米粒子的同源靶向效果,利用DOX作为模型药物,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测Hep-G2和COS-7对纳米粒子的摄取情况及细胞内药物分布。 将包覆了不同细胞膜(Hep-G2、COS-7、MCF-7和HeLa细胞膜)的纳米粒子与Hep-G2细胞共同孵育,如图5A显示,包覆了同源细胞Hep-G2细胞膜的纳米粒子在Hep-G2细胞中的荧光强度明显高于包覆异源细胞膜(COS-7)的纳米粒子(约为1.5倍)。 同时,也评估了P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2)纳米粒子对不同细胞(Hep-G2、COS-7细胞)的靶向特异性,同样地,Hep-G2细胞内的荧光强度明显高于COS-7细胞(图5C)。 流式细胞仪结果分析也同样验证了这种差异(图5B和图5D)。 以上结果表明,相对于异源细胞膜,包覆同源细胞膜的纳米粒子对于同源细胞具有高的靶向特异性。

图5 纳米粒子的细胞摄取情况。(A)激光共聚焦显微镜成像和(B)流式细胞仪分析包覆不同细胞膜((I)Hep-G2, (II)COS-7, (III)MCF-7, (IV)HeLa细胞)载药纳米粒子在Hep-G2细胞中的摄取情况。(C)激光共聚焦显微镜成像和(D)流式细胞仪分析Hep-G2 和COS-7细胞对于P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2)纳米粒子的摄取情况Fig.5 Cellular uptake of nanoparticles. (A)CLSM image and (B)flow cytometry profiles of nanoparticles with different cell membrane ((I)Hep-G2, (II)COS-7, (III)MCF-7and (IV)HeLa cells) coincubation with Hep-G2 cells. (C)CLSM image and (D)flow cytometry profiles of Hep-G2 cell and COS-7 cell incubated with P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2)

2.5 不同细胞微环境对包覆细胞膜纳米粒子释药行为的影响

进一步研究了不同细胞微环境对纳米粒子释药行为的影响。 如图6A和6B所示,由于Hep-G2内高浓度GSH的存在,当纳米粒子进入Hep-G2细胞后,含有二硫键的P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2)纳米粒子响应GSH还原环境迅速释放药物DOX并进入细胞核,使得Hep-G2细胞在胞质及细胞核中均显示强的DOX荧光;而不含二硫键的P-G/D/DOX@M(Hep-G2)纳米粒子在胞内缓慢释放DOX,只有少量的DOX进入细胞核。 且由于未释放的DOX在纳米粒子内由于聚集而产生荧光淬灭,因此非还原敏感P-G/D/DOX@M(Hep-G2)纳米粒子处理的Hep-G2细胞呈现低强度的DOX荧光。 而在含有浓度较低GSH的COS-7细胞中,P-ss-G/D/DOX@M(COS-7)及P- G/D/DOX@M(COS-7)纳米粒子的释药行为无显著区别(图6C及6D)。

图6 不同细胞微环境对包覆细胞膜纳米粒子释药行为的影响。(A)激光共聚焦显微镜成像和(B)流式细胞仪分析 (I)P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2)和(II)P-G/D/DOX@M(Hep-G2)载药纳米粒子在Hep-G2细胞中的摄取情况。(C)激光共聚焦显微镜成像和(D)流式细胞仪分析 (I)P-ss-G/D/DOXf@M(COS-7)和(II)P-G/D/DOX@M(COS-7)载药纳米粒子在COS-7细胞中的摄取情况Fig.6 (A)CLSM image and (B)flow cytometry profiles of (I)P-ss-G/D/DOX@M(Hep-G2) and (II)P-G/D/DOX@M(Hep-G2) nanoparticles coincubation with Hep-G2 cell. (C)CLSM image and (D)flow cytometry profiles of (I)P-ss-G/D/DOX@M(COS-7) and (II)P-G/D/DOX@M(COS-7) coincubation with COS-7 cell

2.6 纳米粒子的体外抗肝癌活性

首先利用MTT实验评价P-ss-G/D/Sf@M纳米粒子对Hep-G2的体外治疗效果。 从图7A中可以看出,包覆细胞膜后能降低空白纳米载体的细胞毒性,其中P-ss-G/D@M(Hep-G2)和P-G/D@M(Hep-G2)纳米粒子在检测浓度下细胞存活率均高于90%,说明该载体具有良好的生物相容性。相对于包覆异源细胞膜的载药纳米粒子P-ss-G/D/Sf@M(COS-7)和不含二硫键的载药纳米粒子P-G/D/Sf@M(Hep-G2),P-ss-G/D/Sf@M(Hep-G2)作用于Hep-G2细胞后具有最高的细胞毒性。 进一步利用细胞凋亡分析考察纳米粒子的抗肝癌活性,如图7B所示,同源细胞膜包覆还原响应释药的P-ss-G/D/Sf@M(Hep-G2)纳米粒子诱导的细胞凋亡水平(早期凋亡42.0%,晚期凋亡51.7%)明显高于非还原P-G/D/Sf@M(Hep-G2)(早期凋亡50.6%,晚期凋亡16.0%)和包覆异源细胞膜纳米粒子P-ss-G/D/Sf@M(COS-7)(早期凋亡24.6%,晚期凋亡44.5%)。 以上结果均表明,P-ss-G/D/Sf@M(Hep-G2)纳米粒子由于其能够特异性靶向Hep-G2细胞,且在肿瘤细胞高GSH作用下二硫键能够迅速断裂,释放所载药物,从而实现了良好的抗肝癌效果。

图7 纳米粒子的体外抗肝癌效果。(A)纳米粒子和载药纳米粒子作用于Hep-G2细胞后的细胞毒性。(B)流式细胞术分析载药纳米粒子诱导的Hep-G2细胞凋亡水平Fig.7 Anti-tumor effect of nanoparticles. (A)The cytotoxic profiles of nanoparticles and Sf-loaded nanoparticles against Hep-G2 cell. (B)Flow cytometric analysis of Hep-G2 cell apoptosis after coincubation with Sf-loaded nanoparticles

3 结 论

成功制备了一种由同源细胞膜包覆的还原敏感脂质纳米粒(P-ss-G/D/Sf@M),粒径约为140 nm,具有较高的载药量以及良好的生物相容性。 体外细胞实验表明,包覆了肝癌细胞膜的P-ss-G/D/@M(Hep-G2)纳米粒子更易被肝癌细胞摄取,具有良好的肝癌靶向性,且该纳米粒子在血液循环过程中结构保持稳定,在细胞内快速分解并迅速释放药物,对肝癌 HepG-2细胞呈现出较强的增殖抑制活性和诱导凋亡能力。 因此利用仿生细胞膜和肿瘤微环境响应性脂质体纳米粒的组合可同时实现药物在肿瘤部位的有效富集和可控释放,为抗肿瘤药物在精准医疗领域的应用提供了新思路。

辅助材料(Supporting Information)[Sf的浓度-吸光度标准曲线]可以免费从本刊网站(http://yyhx.ciac.jl.cn/)下载。

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