LK2010型电化学工作站(天津市兰力科化学电子高技术有限公司);三电极系统(上海辰华仪器有限公司):玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极。

三氟氯氰菊酯(99%),吡咯(pyrrole,Py,99%),上海酶联生物科技有限公司;邻苯二胺(OPD,纯度99.5%),邻氨基苯酚(OAP,98%),间苯二酚(resorcinol,PAR,99%),阿拉丁试剂有限公司;铁氰化钾,氯化钾,乙腈(分析纯,天津市永大化学试剂有限公司);磷酸氢二钠、硫酸、氢氧化钠、硝酸、磷酸、乙酸、无水乙酸钠、无水乙醇均为市售分析纯试剂;实验用水均为超纯水。 糙米(哈尔滨市松北区)、干辣椒(廊坊市永清县)、桃(石家庄市藁城区)、白菜(石家庄市栾城区),均为市售。

取适量的不同粒径(0.5、0.3、0.05 μm)的Al₂O₃抛光粉分别倒在麂皮表面,依次将玻碳电极(Glassy Carbon Electrode,GCE)在麂皮表面研磨,然后用水将电极冲洗干净并进行超声处理,超声用溶剂依次为质量分数0.5%的HNO₃水溶液、无水乙醇、超纯水(每次10 s);用水冲洗干净后,N₂气吹干,采用电化学法对电极表面进行活化处理,再用水冲洗干净,N₂气吹干;将三电极系统置于探针离子(1 mmol/L K₃[Fe(CN)₆]及1 mol/L KCl水溶液)中,采用CV法,扫描范围-0.2~0.8 V,扫描速率为50 mV/s,进行扫描,直至得到对称且可逆的氧化还原峰,随后用方波伏安法(Square Wave Voltammetry,SWV)进一步进行验证,并读取电流值,取出电极待用^[15]。

将电势设置为-0.2~1.5 V,扫描速度为50 mV/s,将玻碳电极置于含有2 mmol/L的三氟氯氰菊酯、15 mmol/L OPD以及15 mmol/L OAP的NaAc-HAc(pH=5.2)溶液中,电聚合20圈,N₂气吹干,得到致密的三氟氯氰菊酯印迹聚合膜电极(M-MIP/GCE)。 将印迹电极浸泡在洗脱剂乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积3:1)中,去除聚合膜内的模板分子三氟氯氰菊酯,制得三氟氯氰菊酯OPD-OAP复合膜的分子印迹电化学传感器(MIP/GCE)。 在不加三氟氯氰菊酯的情况下,按上述操作制备的电极作为对照电极,即得非印迹电极。

将三电极系统置于探针离子溶液中测量电极的电流响应,采用CV法和SWV法对实验条件进行优化,并对印迹传感器性能进行评价,并结合这两种方法对实际样品进行检测。 电化学测量参数的设定:CV法,扫描电势为-0.2~0.8 V和扫描速率为50 mV/s;SWV法,起止电势为-0.1~0.6 V、电势增量0.005 V、脉冲幅度0.02 V、频率5 Hz。

称取粉碎或捣碎后的样品(糙米、干辣椒、桃、白菜)2.000 g,分别置于50 mL离心管中,用15 mL乙腈提取(分两次提取,第1次10 mL,第2次5 mL),经2 min振荡、10 min超声、10 min离心(4000 r/min)后,合并两次上清液,用乙腈定容至20 mL,待测^[16]。

采用Origin 8.0和Excel 2016对实验数据进行作图及统计分析,每组实验重复测量3次,数据均为3次平行实验平均值。

采用CV法对三氟氯氰菊酯自身的电化学活性进行了考察(图2)。 由图2可知,三氟氯氰菊酯在聚合电势范围内未出现氧化还原峰,即未发生氧化还原反应,表明三氟氯氰菊酯不能直接采用电化学分析法进行测定^[17]。 因此,本实验采用分子印迹技术,制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器,结合电化学分析方法,借助电活性探针间接检测农产品中的三氟氯氰菊酯残留。

图2

Fig.2

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	图2 在醋酸钠缓冲液(pH=5.2)中三氟氯氰菊酯的CV图Fig.2 CV diagrams of cyhalothrin in sodium acetate buffer solution(pH=5.2)

目前,常用于制备印迹聚合物膜的功能单体主要以氢键与模板分子相互作用,对于有些结构比较复杂的模板分子可以采用双功能单体或多种功能单体^[15,18]。 根据该作用原则实验初步对有可能成为功能单体的Py、OPD、OAP和PAR进行了考察。 实验发现,分别以Py、OPD、OAP和PAR作为功能单体,在电聚合过程中均可产生氧化还原峰,但当Py、PAR分别作为功能单体时,电聚合过程中响应峰电流值较小,当OPD、OAP分别作为功能单体时响应峰电流值较大,且聚合效果良好。 实验又将以上4种功能单体两两混合进行电聚合,结果如图3所示。 当OPD-OAP作为复合功能单体时具有最佳的聚合效果(见图3F),在电极表面,OPD-OAP可迅速聚合形成致密的且不导电的聚合物膜且响应峰电流值最大,随后将该电极置于探针离子溶液中进行表征,发现电流响应几乎为零,说明该膜具有良好的绝缘性,因此实验选择OPD-OAP作为最佳复合功能单体。

图3

Fig.3

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	图3 在醋酸钠缓冲溶液(pH=5.2)中功能单体的电聚合曲线Fig.3 Electropolymerization curves of functional monomers in sodium acetate buffer solution(pH=5.2) A.Py-OPD; B.Py-OAP; C.Py-PAR; D.OAP-PAR; E.OPD-PAR; F.OPD-OAP

2.3.1 模板分子与功能单体比例的确定

大量研究表明^[19,20],过多和过少的功能单体均会对印迹电极的灵敏度和稳定性产生影响,如果功能单体用量过少,会阻碍单体间的聚合,使膜形成的时间过长,相应印迹位点数量会减少,致使电极的灵敏度降低;若功能单体用量过多导致自身缔合,其与模板分子间的空间位阻增大,进而使相应印迹位点数量也会减少,电极的灵敏度也会降低,稳定性下降。 实验首先将功能单体的浓度固定为20 mmol/L,然后分别选取0.1、0.2、0.5、1、2和3 mmol/L 6种不同浓度的模板分子进行电聚合制备分子印迹膜。 通过实验可知,当模板分子摩尔浓度为2 mmol/L时,印迹效果最佳。 由于OPD和OAP的相对分子质量十分相近,所以选取了相同浓度的OPD和OAP进行电聚合,模板分子与复合功能单体 c(M): c(OPD): c(OAP)分别为2:5:5、2:10:10、2:15:15、2:20:20、2:25:25和2:30:30,结合紫外光谱法比较其最大吸收波长对应的吸光值,对模板分子与功能单体的比例进行优化。 当三氟氯氰菊酯、OPD和OAP混合体系中的吸光值趋于平缓时,表明三者之间的作用已趋于稳定,此时平缓区的转折点所对应的浓度比即为最佳比例^[21]。 结果如图4所示,在2:20:20~2:30:30范围内,吸光值变化趋于稳定,因此确定模板分子与功能单体的最佳浓度比为2:20:20。

图4

Fig.4

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	图4 聚合比例优化曲线Fig.4 Optimization curve for the polymerization ratio c(M): c(OPD): c(OAP):a.2:5:5; b.2:10:10; c.2:15:15; d.2:20:20; e.2:25:25; f.2:30:30

2.3.2 聚合电解质的选择

分别考察了NaAc-HAc(pH=5.2)、PBS(pH=7.2)、KCl-HCl(pH=7.0)和HCl(pH=1.0)作为聚合电解质溶液对聚合效果的影响(图5)。 实验表明,以PBS(pH=7.2)为电解质溶液时,由于三氟氯氰菊酯在PBS(pH=7.2)溶液中溶解度较小,故出现沉淀现象;由图5可以看出,当以上述其余溶液作为电解质溶液时,只有在NaAc-HAc(pH=5.2)电解质溶液(图5C)中成膜速度最快,且响应峰电流值最大;聚合后将印迹电极置于探针离子溶液中进行表征,发现该膜稳定性最强,绝缘性更好,因此本实验选择NaAc-HAc溶液(pH=5.2)为聚合电解质溶液。

图5

Fig.5

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	图5 在不同电解质溶液中的聚合情况比较Fig.5 Comparison of polymerization in different electrolyte solutions A.HCl(pH=1.0); B.KCl-HCl(pH=7.0); C.NaAc-HAc(pH=5.2)

2.3.3 聚合电势的选择

分别选择了0~1.2、0~1.5、0~1.7、-0.2~1.5、-0.2~1.7 V不同的聚合电势进行电聚合,并在探针溶液中对聚合效果进行考察。 由图6可以看出,当选择聚合电势为0~1.5 V和-0.2~1.7 V时,分子印迹聚合膜在进行洗脱时有明显的脱落现象;当聚合电势为0~1.7 V时,峰电势出现正移现象且洗脱后印迹膜有脱落问题;当电势在0~1.2 V范围内聚合时,模板分子难以被洗脱;当电势在-0.2~1.5 V范围时,聚合物膜的稳定性强且洗脱效果良好,所以该实验最佳聚合电势为-0.2~1.5 V。

图6

Fig.6

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	图6 聚合电势对洗脱效果的影响Fig.6 Effect of polymerization potential on elution

2.3.4 聚合圈数的优化

采用CV法,通过聚合圈数控制聚合膜的厚度。 在聚合过程中,如果聚合圈数太少会导致聚合膜过薄,膜在电极上不稳定,易在洗脱时脱落,且形成印迹空穴较少,降低传感器的特异识别性;而聚合圈数过多则形成的印迹膜太厚,印迹膜中的模板分子难以洗脱出来,形成的特异性识别空穴过少,还会阻碍探针离子穿过空穴在电极表面进行电子转移,从而影响测定效果。 我们分别将电极在聚合液中聚合5、10、15、20、25和30圈,然后将聚合电极浸泡在洗脱剂中去除模板分子三氟氯氰菊酯,再结合CV和SWV对印迹电极进行表征;由图7可以看出,当聚合圈数为20圈时,响应峰电流值高,且膜厚适宜,说明聚合圈数为20圈时该电极的印迹效果最好。 因此,20圈为该实验最佳聚合圈数。

图7

Fig.7

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	图7 聚合圈数的选择Fig.7 Selection of polymerization cycle number

洗脱剂和洗脱时间的选择对于传感器的选择性有着很大影响。 由于三氟氯氰菊酯在酸性条件下稳定,碱性条件下不稳定,且溶于有机溶剂,本文初步选取了乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)、乙醇/0.4 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)和乙醇/水(体积比3:1)3种溶液作为洗脱剂;通过考察各洗脱剂对模板分子的洗脱效果发现,当乙醇/水(体积比3:1)溶液作为洗脱剂时,模板分子洗脱困难;当乙醇/0.4 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)作为洗脱剂时,由于NaOH的浓度太高,溶液碱性过大,使印迹聚合膜不稳定造成膜的脱落。 而乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)洗脱效果良好。

为了研究洗脱剂对OPD-OAP聚合膜是否有影响,将OPD-OAP聚合膜电极置于洗脱剂乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)中浸泡10 min,随后用水冲洗干净,N₂气吹干后,将电极置于探针离子溶液中,采用CV法进行表征。 结果为电流响应几乎为零,表明OPD-OAP聚合膜在乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)的环境下是稳定的,即洗脱剂对OPD-OAP聚合膜基本无影响。

为了有效去除印迹聚合膜中的模板分子三氟氯氰菊酯,实验在确定了洗脱剂之后又对洗脱时间进行了优化。 将印迹电极浸泡于洗脱剂乙醇/0.04 mol/L NaOH水溶液(体积比3:1)中,每隔1 min取出电极,采用CV法进行表征。 结果表明,洗脱时间到达5 min时峰电流达到10.6 μA,而随着洗脱时间的增加峰电流值不再增大,表明印迹聚合膜中的三氟氯氰菊酯已经洗脱完全,因此,5 min为最佳洗脱时间。

按照1.3节方法制备印迹传感器后,将印迹电极浸入0.01 mmol/L的三氟氯氰菊酯标准溶液中,每隔2 min取出电极,于探针溶液中对印迹电极进行表征。 结果显示,峰电流值随着吸附时间的增加而降低,当响应峰电流值达到最小值且趋于稳定时,说明模板分子已经被吸附完全,而当吸附14 min时,响应电流基本保持不变,此时电极达到吸附平衡,因此最佳的吸附时间是14 min。

实验选取与三氟氯氰菊酯结构类似的联苯菊酯和胺菊酯以及与三氟氯氰菊酯结构相差较大的联苯三唑醇和克百威作为干扰物质来考察传感器的选择性。 将电极分别浸入相同浓度(0.01 mmol/L)的三氟氯氰菊酯以及干扰物质溶液中,采用CV和SWV对电流的响应值进行考察,计算相对峰值电流变化(Δ I)情况,Δ I表示印迹电极洗脱模板分子后峰电流与印迹聚合膜吸附目标物质后峰电流的差值,Δ I越大,表明传感器对目标物质的选择性越高。 由图8可以看出,吸附相同浓度的三氟氯氰菊酯与干扰物,印迹电极对模板分子的Δ I值最大,其次是其结构类似物联苯菊酯和胺菊酯,而对联苯三唑醇和克百威电流响应值很弱。 这是由于联苯菊酯和胺菊酯在分子结构上与三氟氯氰菊酯较为相似,使得部分联苯菊酯和胺菊酯能够吸附到印迹电极的识别空穴中与功能单体结合,从而引起响应电流的变化,说明该传感器能够对三氟氯氰菊酯及其结构类似物进行测定;而联苯三唑醇和克百威与模板分子的结构差异较大,联苯三唑醇和克百威几乎不能够吸附到印迹电极的识别空穴中,所以几乎无响应电流信号,说明该传感器选择性良好。

图8

Fig.8

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	图8 分子印迹聚合膜电极的选择性Fig.8 Selectivity of the molecularly imprinted polymeric membrane electrode A.Cyhalothrin; B.Bifenthrin; C.Tetramethrin; D.Bitertanol; E.Carbofuran

采用CV和SWV两种方法验证三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器的印迹效应。 由图9A中CV曲线可知,裸电极(GCE,图9A曲线a)的响应峰电流值最大,且有一对较为对称的氧化还原峰,峰的比例接近1:1,这是由于此时探针离子在玻碳电极表面进行的电子转移几乎没有任何阻碍;当裸电极在聚合液中进行电聚合后(图9A曲线d),电极(M-MIP/GCE)表面的响应电流值最小,几乎为,这是由于此时模板分子与两种功能单体在该电极表面形成了致密的、几乎不导电的聚合膜,探针离子在电极表面的电子转移受到了聚合膜的阻碍;洗脱模板分子后的印迹电极(MIP/GCE)CV曲线(图9A曲线b)与图9A曲线d相比响应峰电流值有了显著的提高,且出现了氧化还原峰,这是由于印迹膜上模板分子被洗脱后,在电极表面形成了具有特异识别性的空穴,探针离子可以通过这些印迹空穴在玻碳电极表面进行电子转移;然后将印迹电极MIP/GCE浸于三氟氯氰菊酯标准溶液中,电极吸附模板分子后(Mad-MIP/GCE,图9A曲线c)与洗脱模板分子后的印迹电极MIP/GCE(图9A曲线b)比较,响应峰电流值明显下降,且依然存在氧化还原峰,这是由于部分模板分子再次占据印迹空穴阻碍了探针离子在电极表面进行电子转移,探针离子可通过的空穴数量较少,响应电流值也随之降低,说明该传感器具有良好的印迹效应。图9B为SWV表征曲线,通过比较图9A与9B可以看出两种表征方法效果一致。

图9

Fig.9

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	图9 不同电极在表征溶液中的CV和SWV曲线Fig.9 CV and SWV curves of different electrodes in the characterization solution a.GCE; b.MIP/ GCE; c.Mad-MIP/GCE; d.M-MIP/GCE

配制了不同浓度的三氟氯氰菊酯标准溶液(1.0×10^-8~1.0×10^-4 mol/L),采用CV和SWV在1 mmol/L K₃[Fe(CN)₆]及1 mol/L KCl的表征溶液中,测定分子印迹聚合膜电极对空白溶液与对不同浓度三氟氯氰菊酯标准溶液吸附后的响应电流值,以三氟氯氰菊酯标准溶液浓度为横坐标,Δ I为纵坐标作图,绘制标准曲线,其线性方程为Δ I=625.3 x+0.7471,线性相关系数为 R²=0.9995,线性范围为1.0×10^-7~1.0×10^-5 mol/L,检出限为3.0×10^-8 mol/L( S/N=3)。

在最佳实验条件下,农产品样品在1.0×10^-7 mol/L和5.0×10^-6 mol/L 2个添加水平下进行样品加标回收率实验,分析结果如表1所示,样品加标平均回收率在84.8%~94.7%之间,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)在1.1%~4.8%之间( n=5)。 结果表明,该方法的回收率和精密度良好。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 回收率和精密度( n=5) Table 1 Recovery and precision( n=5) Added levels/(mol·L-1) Brown rice Dried chili Peach Chinese cabbage 1.0×10-7 5.0×10-6 1.0×10-7 5.0×10-6 1.0×10-7 5.0×10-6 1.0×10-7 5.0×10-6 Number of measurements Recovery/% 1 84.9 82.3 89.3 91.6 89.3 88.2 94.3 87.2 2 84.4 86.8 90.7 89.6 93.9 91.5 94.5 83.1 3 83.4 85.2 88.7 92.2 92.3 88.2 95.8 86.1 4 86.6 86.5 89.6 93.5 89.7 88.9 95.7 85.3 5 88.1 83.1 91.0 93.9 92.7 91.8 93.3 84.4 Average recovery/% 85.5 84.8 89.9 92.1 91.6 89.7 94.7 85.2 Relative standard deviation/% 4.1 4.8 1.1 3.2 4.4 3.5 1.1 2.9

表1 回收率和精密度( n=5) Table 1 Recovery and precision( n=5)

样品按照1.5节方法处理后,将样品处理液10 mL置于电解杯中,在1.4节条件下进行吸附检测,检测结果为样品中未检出三氟氯氰菊酯。 而且以实际样品糙米和白菜为例,对本方法即分子印迹电化学传感器法(Molecularly imprinted electrochemical sensor,MIECS)和高效液相色谱法^[22]的测定结果(回收率)进行了比较,结果如表2所示。 依据t检验法评价了两种检测方法的等效性。 选取显著性水平 α=0.05,由表2数据可知自由度为 f=8,由t检验法计算统计量 t值(见表2)。 查 t值表,得 t_0.05,8=2.3。 因 t< t_0.05,8,所以两种检测方法的测定结果无显著性差异,即分子印迹电化学传感器法与高效液相色谱法测定结果基本一致。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 两种检测方法的样品加标回收率数据和 t值 Table 2 Sample spike recovery data of two determination methods and t values Sample Added levels/(mol·L-1) Method Recovery/% t Brown rice 1.0×10-7 MIECS 85.0 85.2 84.8 86.9 89.5 1.4 HPLC 86.7 90.1 90.6 91.7 88.9 5.0×10-6 MIECS 82.1 87.2 85.3 86.5 83.2 1.8 HPLC 90.9 92.0 87.3 90.9 88.2 Chinese cabbage 1.0×10-7 MIECS 93.6 93.2 95.5 96.1 93.2 1.6 HPLC 89.2 90.7 94.0 89.9 92.7 5.0×10-6 MIECS 87.2 83.1 86.1 85.3 84.4 1.7 HPLC 90.6 91.9 91.5 87.3 89.2

表2 两种检测方法的样品加标回收率数据和 t值 Table 2 Sample spike recovery data of two determination methods and t values

在优化后的实验条件下采用CV和SWV连续使用三氟氯氰菊酯印迹传感器20次,Δ I的RSD≤6.61%( n=20),表明该传感器具有良好的重现性。 实验将印迹传感器在4 ℃条件下保存21 d,每隔7 d进行测定,该传感器分别在第0、7、14和21 d时对0.01 mol/L三氟氯氰菊酯标准溶液进行测定,将实验开始的测量值设为初始测量值,第7、14和21 d分别为初始值的88.2%、85.6%以及82.1%,表明该传感器具有良好的稳定性。