环六肽Thermoactinoamide A的固相合成及其抗菌活性
杨瑾, 马琪森, 钟颖, 朱龙宝*, 葛飞, 陶玉贵, 宋平
安徽工程大学生物与化学工程院 安徽 芜湖 241000
通讯联系人:朱龙宝,教授; Tel:0553-2871254; E-mail:swgctaoyg@126.com; 研究方向:多肽的固相合成
摘要

采用固相-液相两步法合成一种天然抗菌环肽Thermoactinoamide A。 在9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成的基础上,通过优化 N, N-二异丙基乙胺(DIPEA)的添加量,得到直链肽,收率为84%,在此基础上,采用液相环合的方法对直链肽进行环合,通过优化环合体系中混合液的配比、初始pH等条件,得到Thermoactinomide A,收率为51%,总收率43%。 抑菌实验结果表明,Thermoactinoamide A对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为32 μg/mL。 固相合成与液相环合两步法合成步骤少、过程简单、产率较高,为进一步研究该天然产物的生物活性及构效关系奠定了基础。

关键词: Thermoactinoamide A; 固相合成; 环肽; 抑菌活性
中图分类号:O621.3 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2019)06-0677-06
Solid-Phase Synthesis of Cyclohexapeptide Thermoactinoamide A and Its Antibacterial Activity
YANG Jin, MA Qiseng, ZHONG Ying, ZHU Longbao, GE Fei, TAO Yugui, SONG Ping
School of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu,Anhui 241000,China
Corresponding author:ZHU Longbao, professor; Tel:0553-2871254; E-mail:swgctaoyg@126.com; Research interests:solid phase synthesis of peptide
Abstract

A natural antibacterial cyclic peptide thermoactinoamide A was synthesized by solid-liquid phase two-step method. First, based on fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) solid phase synthesis, the linear peptide was obtained in 84% yield by optimizing the addition of N, N'-diisopropylethylamine(DIPEA). Then the linear peptide was converted to thermoactinoamide A in 51% yield(43% yield total) through optimizing the cyclization conditions. Antibacterial activity test results show that minimum inhibitory concentration of cyclic thermoactinoamide A for Staphylococcus aureus is 32 μg/mL. In summary, an effectively synthetic strategy was developed for further applications of cyclic peptide thermoactinoamide A on analyzing the structure-activity relationship and improving the bioactivity.

Keyword: thermoactinoamide A; solid-phase synthesis; cyclic peptide; antibacterial activity

天然抗生素在对抗耐药细菌方面发挥着重要的作用[1,2]。 目前已经批准上市的20多种抗生素中,仅有3种(磺胺药物,喹诺酮和恶唑烷酮)不是基于天然抗生素结构研发的药物[3]。 研究生活在特殊环境中的微生物,更有可能发现新的天然抗生素[4]。 Thermoactinomide A是从冰岛嗜热细菌菌株ISCAR 2354中分离出的一种由D型和L型氨基酸组成的新型环六肽,由6个氨基酸残基构成,结构为:Cyclic[ D-Tyr- D-allo-Ile- L-Leu- D-Leu- L-Leu- L-Val](图1),相对分子质量为714.47[5,6]。 基于环状抗菌肽的不断发现,含有D/L混合型的结构被认为是很有前景的抗菌先导化合物[7,8,9]。 自2017年发现以来,对其研究仅局限于分离、纯化及结构鉴定等工作。 由于在自然界中的含量非常低,要对其进行抗菌机理,构效关系研究,仅依靠从微生物代谢产物中提取无法满足需要。 因而,采用固相-液相两步法对其进行化学合成,探讨固相合成条件对天然环肽收率的影响及环肽的抗菌性能,以满足目前天然多肽抗菌机理、构效关系研究的需要。

图1 Thermoactinomide A的结构式Fig.1 The structure of thermoactinoamide A

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

Bruker Ultrashield 400 PLUS型核磁共振谱仪(NMR,德国Bruker公司),TMS为内标,DMSO为溶剂;LC-20A型高效液相色谱仪(HPLC,日本岛津公司);ChiralPak AS-H型色谱柱(日本DAICEL Chemical公司);LCMS-8030型三重四极杆质谱仪(MS,日本岛津公司);UV-2450型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基氯树脂、2-(7-氧化苯并三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)购自于上海吉尔生化有限公司; N, N'-二异丙基乙胺(DIPEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)、1-羟基苯并三氮唑(HoBt)、冰醋酸均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水二氯甲烷(DCM)、无水 N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)购自上海阿达玛斯试剂有限公司;GE Healthcare Sephadex LH-20购自广州市齐云生物技术有限公司;牛肉膏、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白均购自国药集团化学试剂有限公司。 以上试剂纯度均为分析纯。 肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae NCTC 7466、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 29213、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ATCC 6051和 Bacillus subtilis ATCC 6633由安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心提供。

1.2 实验方法

天然抗菌环肽Thermoactinoamide A的固相合成按Scheme 1路线进行合成[6]

Scheme 1 Synthesis of thermoactinomide A

1.2.1 直链肽树脂的合成

称取二氯三苯基氯树脂1000 mg(载样量为1.03 mmol/g)加入到固相合成反应管中,加入20 mL DCM 浸泡0.5 h,抽干待用。 将Fmoc- D-Tyr( tBu)-OH(322 mg,0.7 mmol)和DIPEA(754 μL,4.3 mmol)混溶于10 mL DCM,加入到抽干待用的树脂中,通入N2气,反应2 h,抽滤后,分别用DCM和DMF各洗涤3遍。 加入20 mL V(甲醇): V(DCM)=1:4的混合液,反应0.5 h,对未反应完的树脂进行封闭,抽滤后,分别用DCM和DMF各洗涤3遍,抽干待用,随机取出10多粒树脂放入检测管中,滴加检测试剂,沸水浴1 min,树脂无颜色变化,表明得到Fmoc-Tyr( tBu)-Resin(1)。

向反应管中加入20 mL V(哌啶): V(DMF)=1:4的混合溶液,反应30 min,用于脱除Fmoc保护基。 反应结束后,分别用DCM和DMF各洗涤5遍,抽干待用,随机取出10多粒树脂放入检测管中,滴加检测试剂,沸水浴1 min,树脂变蓝,表明得到NH2-Tyr( tBu)-Resin(2)。 重复上述连接氨基酸的步骤,在加入缩合试剂TBTU(278 mg,0.9 mmol)和DIPEA(661.6 μL,3.6 mmol)的情况下,依次接入Fmoc- D-allo-Ile-OH、Fmoc- L-Leu-OH、Fmoc- D-Leu-OH、Fmoc- L-Leu-OH和Fmoc-Val-OH,重复缩合→脱保护→缩合的步骤,每步反应结束后,通过检测试剂监测反应的进程,最终得到NH2-Val- L-Leu- D-Leu- L-Leu- D-allo-Ile-Tyr( tBu)-Resin(3)。

1.2.2 直链肽树脂的切割

按照 V(冰醋酸): V(三氟乙醇): V(DCM)=1:1:8的比例配制切割试剂。 将1.2.1节中得到的直链肽树脂(3),抽滤1 h,得到干燥的黄色固体,转移至50 mL离心管中,加入30 mL切割试剂,0 ℃,振荡反应2 h,将滤液抽滤至100 mL茄型瓶中,减压浓缩,得到淡黄色粉末状固体1988 mg,即直链肽(4)的粗品。

1.2.3 直链肽的分离纯化

将直链肽的粗品用甲醇溶解,通过制备型HPLC纯化。 色谱条件:制备柱为C18反向柱(250×50 mmol/L,5 μm);检测波长220 nm;流动相A为0.08%(体积分数)TFA的乙腈溶液,流动相B为0.08%(体积分数)TFA的水溶液,梯度洗脱(0~30 min,流动相A:20%~80%);流速30.0 mL/min。 直链肽纯品保留时间为15.92 min,经冷冻干燥,得到1863 mg,收率84%。

直连肽(4)白色粉末状的固体,收率84%;LC-MS计算值C38H62N6O7 [M+H]+ 789.55,[M+Na]+ 811.50实测值[M+H]+ 789.55,[M+Na]+ 811.50。

1.2.4 直链肽的环合

分别称取HoBt(428.4 mg,3.2 mmol)、PyBOP(1649.7 mg,3.2 mmol)和DIPEA(1104 μL,6.4 mmol)溶于500 mL无水DCM溶剂中,将溶液加入到2000 mL茄型瓶中。 再称取直链肽500 mg溶于500 mL(300 mL无水DCM和200 mL无水DMF),将溶液添加到恒压滴液漏斗中。 将上述装置连接后抽真空,充Ar气保护,茄型瓶置于0 ℃的冰水中,缓慢滴加恒压滴液漏斗中的溶液,10 h滴加完毕后,室温反应过夜。 先使用水泵减压蒸馏,除去反应液中的DCM,再使用油泵对其减压蒸馏,除去反应液中的DMF。 以甲醇为缓冲液,用Sephadex LH-20凝胶柱,收集含有多肽溶液的部分,合并在茄型瓶中,减压蒸馏,得淡黄色粉末状固体366 mg,即带侧链保护基的环六肽(5)的粗品。

1.2.5 脱保护

将带侧链保护基的环六肽粗品置于50 mL离心管中,加入 V(TFA): V(DCM)=9:1的混合溶剂15 mL,振荡2 h,将混合溶液转移至茄型瓶中,减压蒸馏,得淡黄色粉末状固体,即环肽Thermoactinomide A的粗品。

1.2.6 环肽Thermoactinomide A的分离纯化

将环肽Thermoactinomide A的粗品用甲醇溶解,通过制备型HPLC纯化。 色谱条件:制备柱为C18反向柱(250×50 mmol/L,5 μm);检测波长220 nm;流动相A为0.08%(体积分数)TFA的乙腈溶液,流动相B为0.08%(体积分数)TFA的水溶液,梯度洗脱(0~20 min,流动相A:20%~80%);流速30.0 mL/min。 环肽Thermoactinomide A纯品保留时间为20.27 min,经冷冻干燥,得到白色粉末状的固体255 mg,由直链肽合成Thermoactinomide A的收率为51%。

化合物(5)白色粉末状的固体,产率51%;1H NMR(400 MHz,DMSO),δ:9.27(s,1H),8.52~8.44(d,J=8.0 Hz,1H),8.25~8.18(d,J=8.4 Hz,1H),8.11~7.97(t,J=15.8 Hz,3H),7.92~7.88(d,J=8.0 Hz,1H),7.10~7.04(d,J=8.8 Hz,2H),
6.66~6.62(d,J=8.0 Hz,2H),4.63~4.58(m,1H),4.38~4.31(m,2H),4.23~4.16(m,2H),
3.61~3.57(m,1H),2.87~2.80(m,1H),2.70~2.62(m,1H),2.13~2.06(dd,J=12.2,8.0 Hz,1H),
1.73~1.65(m,1H),1.64~1.54(m,3H),1.52~1.40(m,7H),1.10~1.03(m,1H),0.93~0.77(m,30H);13C NMR(100 MHz,DMSO),δ:174.34,
172.20,171.85,171.12,171.00,156.36,130.57,128.03,115.37,57.42,54.77,50.96,50.50,41.41,41.27,40.56,
40.35,40.15,39.94,39.73,39.52,39.31,36.98,30.42,24.64,24.58,
24.41,23.59,23.46,23.36,22.19,22.11,21.69,18.87,18.86,17.44,15.61,11.26;LCMS计算值C38H62N6O7 [M+H]+ 715.47,[M+Na]+ 737.49,实测值[M+H]+ 715.47,[M+Na]+ 737.49。

1.3 Thermoactinomide A的抑菌活性实验

抑菌实验的测定方法参照文献提供的CLSI-M27A3稀释法[10]

2 结果与讨论
2.1 DIPEA的添加量对直链肽合成的影响

为了提高带保护基的直链肽的合成纯度,省去对带保护基的直链肽进行分离纯化的步骤,分别采用HATU和TBTU作为缩合试剂,研究DIPEA的添加量对氨基酸链连接的影响。 控制树脂与第1个氨基酸相连时DIPEA的添加量(6倍化学计量),研究合成路线中从(2)到(3)添加不同DIPEA的量对直链肽(4)纯度的影响,结果如表1所示,采用TBTU为缩合试剂时,随着DIPEA的量的增加,直链肽的纯度在不断提升,但化学计量超过5倍后,直链肽纯度的不再增加;采用HATU为缩合试剂时,随着DIPEA的量的增加,直链肽的纯度在不断下降,可能是环境中的碱性增加导致氨基酸活泼酯生成的较快,伴随着杂质的增多。 鉴于HATU的价格较TBTU高,缩合试剂采用TBTU,同时选用5倍化学计量的DIPEA与TBTU对氨基酸链进行连接。

表1 DIPEA的添加量不同对直链肽(4)纯度的影响 Table 1 Effect of the amount of different DIPEA added on the purity of linear peptide(4)
2.2 溶剂对直链肽环合的影响

在直链肽环合过程中,使用无水DCM作为溶剂进行的环合,后续减压蒸馏溶剂时,操作相对简单;而使用含有DMF的DCM混合溶剂进行环合后,在减压蒸馏时,首先需要使用水泵除去混合液中的DCM,其次再使用油泵在液氮的辅助条件下除去DMF,工作量和操作步骤相对增加,但环肽得率会相对提高。 为此实验通过研究合成路线中从(4)到(5)对直链肽使用不同比例的无水DCM和DMF进行溶解,从而研究溶剂对直链肽环合得率的影响,结果列于表2。 从表2可知,采用不同比例的无水DCM和DMF混合液对环合收率有很大影响,随着DMF比例的增加,环合收率也在不断提高。 当DCM和DMF的体积分别为300和200 mL时,产物的收率为73.3%,此产率虽略低于随后DMF比例增加得到的环合产率,但考虑到后续对混合溶剂处理的工作量,因此采用该比例较为合适。

表2 采用不同比例的无水DCM和DMF混合液对环合产物的影响 Table 2 Effect of different ratios of anhydrous DCM and DMF mixture on cyclization products
2.3 pH值对环合产率的影响

通过控制环合体系中初始pH值,探究酸碱度对环合产率是否有一定的影响,实验结果如表3所示。 从表3可知,在酸性和中性条件下,直链肽不能发生环合;碱性条件下能够发生,但并不是碱性越强环合收率越高,最适合的条件为pH=8.0左右,环合收率最高,达到73.1%,该结果可能是酸性和中性条件下氨基酸不能形成相应的活泼酯,碱性过强时容易造成线性肽不同程度的聚合,从而不能使线性肽发生自身缩合。

表3 溶液的不同pH值对环合收率的影响 Table 3 Effect of different pH of solution on cyclization yield
2.4 Thermoactinomide A抑菌活性分析

采用CLSI-M27A3稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),研究Thermoactinomide A对4种革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度,同时以万古霉素为阳性对照,结果表4所示。 由表4可知,Thermoactinomide A对肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae NCTC 7466、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 6051和ATCC 6633的抑菌效果不明显,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213的最小抑菌浓度为32 μg/mL。

表4 Thermoactinomide A的最小抑菌浓度(MIC,μg/mL) Table 4 Antibacterial activities(MIC, μg/mL) of Thermoactinomide A
3 结 论

报道了一种天然抗菌环肽Thermoactinomide A的高效合成法。 以笏甲氧羰基- O-叔丁基- D-酪氨酸为原料,在Fmoc固相合成的基础上,通过优化 N, N'-二异丙基乙胺(DIPEA)的投料量,获得纯度较高的直链肽,再通过优化环合体系中无水DCM和DMF混合液的配比以及初始pH值,获得环合收率较高的环肽Thermoactinomide A,这种快速高效合成方法的建立,结合其侧链具有裸露—OH的特点,为下一步对该化合物的改造提供了基础。 最后通过抑菌活性实验结果表明,Thermoactinomide A对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌活性,也为进一步研发新的抗菌药物提供了参考和理论依据。

参考文献
[1] Stanton T B. A Call for Antibiotic Alternatives Research[J]. Trends Microbiol, 2013, 21(3): 111-113. [本文引用:1]
[2] Mangoni M L, Di Grazia A, Cappiello F, et al. Naturally Occurring Peptides from Rana temporaria: Antimicrobial Properties and More[J]. Curr Top Med Chem, 2016, 16(1): 54-64. [本文引用:1]
[3] O'Shea R, Moser H E. Physicochemical Properties of Antibacterial Compounds: Implications for Drug Discovery[J]. J Med Chem, 2008, 51(10): 2871-2878. [本文引用:1]
[4] Fischbach M A, Walsh C T, Walsh C T. Antibiotics for Emerging Pathogens[J]. Science, 2009, 325(5944): 1089-1093. [本文引用:1]
[5] Teta R, Marteinsson V T, Longeon A, et al. Thermoactinoamide A, An Antibiotic Lipophilic Cyclopeptide from the Icelandic Thermophilic Bacterium Thermoactinomyces vulgaris[J]. J Nat Prod, 2017, 80(9): 2530-2535. [本文引用:1]
[6] ZHU Longbao, YANG Jin, TAO Yugui. Chemical Synthesis Method and Process of an Antibacterial Cyclic Peptide Thermoactinoamide A: CN1087155605A[P]. 2018-10-30. (in Chinese)
朱龙宝, 杨瑾, 陶玉贵. 一种抗菌环肽Thermoactinoamide A的化学合成方法与流程: 中国, CN1087155605A[P]. 2018-10-30. [本文引用:2]
[7] Son S, Hong Y S, Jang M, et al. Genomics-Driven Discovery of Chlorinated Cyclic Hexapeptides Ulleungmycins A and B from a Streptomyces Species[J]. J Nat Prod, 2017, 45(12): 3025-3031. [本文引用:1]
[8] Song Y X, Li Q L, Liu X, et al. Cyclic Hexapeptides from the Deep South China Sea-Derived Streptomyces scopuliridis SCIO ZJ46 Active Against Pathogenic Gram-Positive Bacteria[J]. J Nat Prod, 2014, 77(8): 1937-1941. [本文引用:1]
[9] Jang J P, Nogawa T, Futamra Y, et al. Octaminomycins A and B, Cyclic Octadepsipeptides Active Against Plasmodium falciparum[J]. J Nat Prod, 2017, 80(1): 134-140. [本文引用:1]
[10] Pfaller M A, Andes D, Diekema D J, et al. Wild-Type MIC Distributions, Epidemiological Cutoff Values and Species-Specific Clinical Breakpoints for Fluconazole and Candida: Time for Harmonization of CLSI and EUCAST Broth Microdilution Methods[J]. Drug Resist Updates, 2010, 13(6): 180-195. [本文引用:1]