3-氨基苯硼酸(APBA,≥98%)、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(CHGTA,≥98%),上海麦克林生化科技有限公司;1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,≥99%)、 N-羟基丁二酰亚胺(NHS,≥99%)、瓜尔胶(GG,粘度5000~5500 cps)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;聚谷氨酸( γ-PGA,平均相对分子质量2.0×10⁵~5.0×10⁵)购自日本和光纯药工业株式会社;实验用蒸馏水为二次蒸馏水。

AVANCE Ⅲ 400 MHz型核磁共振谱仪(¹H NMR,英国布鲁克公司);Nicolet iS50 FT-IR型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR,美国赛默飞世尔科技公司); DHR-2型流变仪(美国TA仪器公司),使用20 mm平行板。

1.2.1 阳离子瓜尔胶(CGG)的制备

按照文献[18]方法制备CGG。 称取0.71 g GG于250 mL三口烧瓶中,加入150 mL去离子水,搅拌30 min,充分溶解;将0.27 g CHGTA与0.15 g NaOH溶于10 mL去离子水中后,逐滴滴入GG水溶液中,在4050 ℃条件下反应18 h。 反应结束后,用盐酸调节pH值为中性,将产物使用异丙醇沉淀,再用70%异丙醇洗涤2次,经冷冻干燥得白色絮状纤维,即为CGG。

1.2.2聚谷氨酸- g-氨基苯硼酸( γ-PGA- g-APBA)的制备

称取0.55 g APBA和0.38 g γ-PGA置于单口烧瓶中,加入60 mL去离子水,冰浴,搅拌至完全溶解;将含有EDC·HCl (3 mmol, 0.58 g)和NHS(9 mmol,1.03 g)的5 mL去离子水溶液逐滴加入反应液中,冰浴反应4 h。 反应结束后,产物用乙醇沉淀,再用去离子水与乙醇的混合溶液透析7 d,除去小分子杂质,每8 h换1次透析溶液。 透析后的样品溶液经冷冻干燥得到淡黄色海绵状固体,即为 γ-PGA- g-APBA。

1.2.3 刺激响应性凝胶的制备

取12.5 mg CGG溶于1 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中;称取68.7 mg γ-PGA- g-APBA溶于2 mL PBS中。 待二者完全溶解后,将 γ-PGA- g-APBA溶液加入CGG溶液中,搅拌均匀,再滴加0.2 mL NaOH溶液(0.3 mol/L),振荡搅拌,即得超分子生物基刺激响应性凝胶。

1.2.4 凝胶自修复性测试

将凝胶用裁刀切成两半,一半使用罗丹明B染液浸没染色,取出后对两部分施加一定外力使两部分断面充分相互接触。 流变学测试:取适量凝胶,使用20 mm平行板,测试频率为1 Hz,测试程序为:1)对凝胶施加0.05%的应变,时间为60 s;2)应变值设置为500%时间设置为15 s;3)重复以上操作,对凝胶的储能模量( G')和损耗模量( G″)进行测试。

在EDC和NHS催化作用下,功能基团APBA可与 γ-PGA发生酰胺化反应生成略带黄色的 γ-PGA- g-APBA。 用FT-IR对改性聚合物的结构进行表征,结果如图2所示。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图2 APBA(a)、 γ-PGA(b)和 γ-PGA- g-APBA(c)的红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of APBA(a), γ-PGA(b) and γ-PGA- g-APBA(c)

图2谱线a中出现了波数在1584、1448 cm^-1处的特征吸收峰,归属于APBA中苯环骨架振动峰,790、702 cm^-1处为苯环间位取代面外变形的振动峰。 γ-PGA为氨基酸的聚合物,在 γ-PGA的红外光谱中(图2谱线b),1727 cm^-1处为—CO—的伸缩振动吸收峰,1532 cm^-1出现—NH—的面内弯曲振动峰,且在750700 cm^-1之间可观测到—NH—的面外弯曲振动峰。 对 γ-PGA- g-APBA的红外谱图进行分析(图2谱线c),图中出现了间取代苯的吸收峰与羰基的吸收峰,同时在波数为1632 cm^-1处出现了酰胺的伸缩振动峰;与未接枝的 γ-PGA相比,其羰基的吸收减弱。 这是由于酰胺基团中氮元素中孤对电子与羰基形成共轭体系,产生诱导效应,从而降低其羰基的吸收。 由此可以初步判断成功制备了 γ-PGA- g-APBA。

γ-PGA- g-APBA的结构进一步用核磁谱图(¹H NMR)验证,结果如图3所示,其中,图3谱线a为 γ-PGA的谱图,图3谱线b为 γ-PGA- g-APBA的谱图。 1.72.3之间的峰归属于 γ-PGA主链中的—CH₂—质子;1.96和1.74处的峰归属于临近—CH—的—CH₂—质子(9号),2.25处的峰归属于临近羰基的—CH₂—质子(8号);3.84.5处的峰为主链中与羧基相连的—CH—的质子峰(10号)。 但其在 γ-PGA- g-APBA的¹H NMR谱图中,该峰分裂为两质子峰(图3谱线b),这是由于氨基苯硼酸与羧基作用生成酰胺键对—CH—的影响,使其电子云密度降低,化学位移增大,向低场移动;处于低场4.3处峰的峰面积越大,APBA的接枝率越高;而7.27.8处的质子峰归属于苯环上质子。 根据¹H NMR谱图中各质子峰面积与氢原子个数的关系,并通过对 γ-PGA- g-APBA结构的分析,由1.72.3和7.27.8处的质子峰的峰面积比即可计算出各比例下APBA的接枝率。 根据计算得, γ-PGA- g-APBA接枝率为29%。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图3 γ-PGA(a)和 γ-PGA- g-APBA(b)的核磁共振谱图Fig.3 1H NMR spectra of γ-PGA(a) and γ-PGA- g-APBA(b)

用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵对GG进行改性,其红外图谱如图4所示。 CGG的FT-IR谱图中(图4谱线b),3349 cm^-1处存在—OH的伸缩振动峰,877和1065 cm^-1处的双峰为醚键—C—O—C—伸缩振动峰,而指纹区1015 cm^-1处的峰为—C—O—的伸缩振动峰,为该区吸收最强的峰。 与GG的红外图谱相比(图4谱线a),CGG图谱中出现965 cm^-1的吸收峰,该峰为—C—N—的伸缩振动峰,说明瓜尔胶改性成功。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图4 GG(a)与CGG(b)的红外光谱Fig.4 FT-IR spectra of GG(a) and CGG(b)

2.2.1 凝胶的形成

分别将 γ-PGA、 γ-PGA- g-APBA与GG、CGG在不同的pH缓冲液中混合,其外观形貌如图5所示的数码照片。 从图5中可见,改性前 γ-PGA与GG、CGG的混合物在弱碱性条件下呈液体状,说明它们均不能形成凝胶(图5B中1、2号样品)。 因改性前 γ-PGA中不含硼酸基团,无法与GG/CGG中二羟基形成硼酸酯键,因而体系中不存在动态可逆键,无法形成凝胶。 将改性后的 γ-PGA- g-APBA与GG、CGG混合后,APBA中硼酸基团与瓜尔胶中的二羟基在弱碱性条件下结合,形成可逆酯键,从而形成凝胶。 但由于GG在水中的溶解度相对较差,可能影响GG与 γ-PGA- g-APBA之间的作用,因而形成的凝胶不稳定,静置一段时间后有去凝胶化现象(图5C中3号样品)。 而改性后CGG在水中的溶解度高,因而其与 γ-PGA- g-APBA在碱作用下易形成凝胶,即使放置一段时间后所制的 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶仍可较稳定存在(图5C中5号样品)。 但若体系中未加入NaOH溶液时,体系pH未达到硼酸酯键形成条件,则无法交联形成交联网络,无法形成凝胶(图5C中4号样品)。 这些结果表明只有在NaOH存在的碱性液中才能形成稳定的 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图5 各样品凝胶化图片Fig.5 Optical images showing the samples A.standing; B.being inverted; C.being inverted after 5 days;1.mixture of γ-PGA and GG, with NaOH solution; 2.mixture of γ-PGA and CGG, with NaOH solution; 3.mixture of γ-PGA- g-APBA and GG, with NaOH solution; 4.mixture of PGA- g-APBA and CGG, without NaOH solution; 5.mixture of PGA- g-APBA and CGG, with NaOH solution

2.2.2 自修复性能

为了研究 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶的自修复性能,将该凝胶切断后(如图6中插图所示),再将其放置一起并对凝胶的自修复性能进行测试;10 s后,切断的凝胶可完全修复,说明凝胶具有自修复性能,这是因为体系中的动态硼酸酯键可再次生成而形成凝胶。 为进一步表征凝胶自修复性能及修复的可重复性,利用旋转流变仪对凝胶进行阶跃式应变扫描,结果如图6所示。 施加较小应变时( γ=0.05%),所制 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶的储能模量( G')约为900 Pa;但在较大应变 ( γ=500%)下,凝胶网络遭到破坏, G'立即下降至~10 Pa,且其储能模量小于损耗模量( G″),即混合物表现为溶胶状态;而再次施加较小的应变( γ=0.05%)时,凝胶的 G'恢复至初始值,说明破损的凝胶可修复完全;多次重复改变应变的大小,凝胶可重复在大应变下破坏后,在小应变作用下,其储能模量与损耗模量均能完全恢复至初始状态,表明该凝胶具有自修复性能,且其自修复行为可多次重复。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图6 自修复凝胶在不同应力下的流变性,插图为凝胶自修复照片Fig.6 Rheology analyses of the self-healing behavior Inset pictures are the photo-images of undamaged hydrogel(A), fresh-cut hydrogel(B), after self-healing(C)

2.2.3 糖响应性

由硼酸基团与顺式1,2-或1,3-二羟基形成的硼酸酯键具有动态可逆性,多糖中同样存在顺式二羟基结构,可与硼酸基团形成硼酸酯键。 因而 γ-PGA- g-APBA与CGG形成的凝胶在糖溶液中时,由于CGG与糖类之间的竞争关系,赋予凝胶糖响应性。 为验证与探究这一猜想,对 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶进行糖响应性测试。 配制4 g/L的葡萄糖溶液,将凝胶浸泡于等体积葡萄糖溶液中,稍稍振荡后,静置2 min, γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶完全去凝胶化,形成溶液状态,如图7所示。 说明葡萄糖与凝胶中的APBA反应生成新的硼酸酯键,而原凝胶中APBA与CGG硼酸酯键被破坏发生解离。因而, γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶具有糖响应性,可应用于药物的控制释放领域。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图7 在糖溶液中未浸泡(A)和浸泡后(B)的凝胶糖响应性数码照片Fig.7 Glucose-responsive property of the γ-PGA- g-APBA/CGG hydrogel without(A) and with(B) glucose

2.2.4 pH响应性

硼酸酯键是由硼酸基团与1,2-或1,3-羟基形成的可逆共价键,而硼酸基团在溶液中存在两种形式,即不带电的三角形式和带电荷的四面体形式,其与二羟基形成稳定硼酸酯键需满足pH>p K_a,在不同的pH值下,硼酸酯键可发生转换,因此赋予凝胶pH响应性。

为了验证 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶的pH响应性,将凝胶置于10 mL离心管,配制一系列pH值分别为6.0、7.0、7.4、8.0及9.0的PBS,取等量缓冲液分别加入凝胶中,对凝胶的状态进行观察。如图8B所示,放置5 d后,凝胶在酸性条件下去凝胶化,变成溶胶状态;而在中性和碱性缓冲溶液中,仍能在一定程度上保持凝胶状态,且随着pH值的增加,凝胶越稳定。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图8 凝胶在不同pH缓冲液中的变化图Fig.8 Optical images of the γ-PGA- g-APBA/CGG hydrogels in (1)pH=6.0, (2)pH=7.0, (3)pH=7.4, (4)pH=8.0, (5)pH=9.0 buffer solutions

为了进一步探究凝胶的pH响应性,使用流变仪对不同pH缓冲溶液中凝胶进行频率扫描测试。设定测试温度为37 ℃,应变恒定为0.1%,在0.1100 rad/s的角频率范围内对凝胶进行测试,凝胶在pH值为7.0、7.4、8.0和9.0的缓冲溶液中的储能模量( G')和损耗模量( G″)如图9A9D所示。

图9

Fig.9

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
'>	图9 不同PBS中凝胶的流变图Fig.9 Rheology analyses of the hydrogels in various PBS A.pH=7.0; B.pH=7.4; C.pH=8.0; D.pH=9.0; E.storage modulus( G') of the hydrogels in different pH

由于硼酸酯键是动态可逆化学键,其断裂和形成的速率存在化学平衡,平衡速率影响到凝胶在不同剪切速率下的粘弹行为。 凝胶的粘弹行为依赖于剪切速率的变化,在较小剪切速率下,剪切速率小于平衡速率,硼酸酯键的断裂与重新形成来得及适应外力变化,分子链有足够时间对外力作用做出响应,因而损耗模量高于储能模量,混合物主要表现为粘性溶胶状;而当剪切速率达到一定值时,剪切速率大于平衡速率,硼酸酯键来不及断裂与重新形成,分子链没有充足的时间解缠结,引起弹性响应,储能模量高于损耗模量,即此时混合物为类固体的凝胶状态,而储能模量与损耗模量的交点即为混合物的凝胶点,也是硼酸酯键断裂与重新形成的速率。 由图9可知,在pH=7.0、7.4的PBS中的凝胶在剪切速率为0.1100 rad/s的范围内均能观察到凝胶点,而pH=8.0、9.0的PBS中的凝胶在这一剪切速率范围内则观察不到凝胶点。 将各凝胶的储能模量进行比较(图9E)可得:随着缓冲溶液的pH值升高,凝胶的储能模量先升高,即相应凝胶强度依次升高。 这是由于随着凝胶环境的pH升高,体系中硼酸酯键的形成的数量更多,且更加稳定,聚合物网络交联密度提高,凝胶强度提高。 同时,由于硼酸酯键更稳定,分子链运动松弛时间延长,需要更长的时间对外力作用做出响应,具体表现即为体系凝胶点降低,即需要更低的剪切速率作用下体系才能表现为粘流态溶胶。

2.2.5 可注射性

可注射性是凝胶在生物医药领域应用所需的基本特性之一。 由于硼酸酯键的形成与p K_a值及体系pH有关,因此对于 γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶而言,体系pH影响其交联程度进而对凝胶强度产生影响。 在一定pH值下,凝胶强度较低,具有可塑性,可使用26G注射针注射且不堵塞针头(图10A),且注射后可保持凝胶状态。

图10

Fig.10

	Figure Option ViewDownloadNew WindowDownload As Powerpoint Slide
	图10 凝胶通过26G针头注射图片(A)及凝胶的剪切变稀行为(B)Fig.10 Optical image of the hydrogel passing through a 26-gauge needle(A) and shear-thinning behavior of self-healing gels(B)

为进一步研究凝胶的可注射性,对其粘度随剪切速率的变化特点进行探究,如图10B所示。 由图可知,随着剪切速率的增加, γ-PGA- g-APBA/CGG凝胶的粘度逐渐降低。 硼酸酯键是动态可逆共价键,使凝胶具有动态可逆的机械性能,在较高的剪切速率下,凝胶动态交联网络瓦解,分子链趋向于在同一个速度梯度下运动,宏观表现为凝胶的粘度下降,因此可利用注射器对凝胶进行注射,即凝胶具有可注射性。