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Xu HAN, Guanyu DING, Qing DONG, et al. Research Progress of Nano-Gene Carriers Based on Liposomes[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 35(7): 735-744
基因治疗是指将外源基因导入目标细胞,用以修正因基因缺陷和异常导致的疾病,达到治疗疾病的目的。 外源基因在细胞中高效、持续地表达是基因治疗成功的关键,这与载体的选择息息相关。 随着科技的发展,脂质体纳米复合物作为基因载体受到人们广泛关注,其具有功能多样、易于修饰、生物相容性好、转染效率高等优点。 本文介绍了脂质体的结构特点,并对磁性纳米、金纳米、量子点、壳聚糖、上转换纳米与脂质体的复合物作为基因载体进行综述和展望。
Gene therapy is a method for curing diseases caused by genetic defects and anomalies through introducing normal foreign genes into targeted cells. Efficient and sustained expression of foreign genes in cells is the decisive factor in gene therapy, which is significantly relied on the vectors used in the treatment. With the development of science and technology, the research of liposome/nanocomposites as gene carriers has widely attracted people's attention, due to the following advantages:versatile functions, easy surface modification, good biocompatibility, high transfection efficiency. Herein, the structure of liposome bilayer was introduced and the complexes of magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, quantum dots, chitosan, upconversion nanoparticles with liposomes as gene carriers have been reviewed and prospected.
基因疗法是通过基因转移技术将外源基因导入受体细胞以治疗由基因缺陷引起的疾病[1]。 由于外源基因易被细胞内的生物酶消化降解,导致其编码蛋白的表达水平降低,影响基因治疗的效果。 基因载体在基因治疗过程中可以有效地保护治疗基因,是基因治疗的关键[2]。 基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类[3]。 病毒载体的转染效率高,但是它存在免疫原性高、毒性大、限制携带基因数量等缺陷,导致其在生物领域中的应用受到一定的限制。 脂质体作为非病毒载体,可以弥补病毒载体的上述缺陷。 不仅如此,脂质体还具有制备简单、易于表面修饰、易于大量生产等优势,是构建基因载体的理想材料。
纳米技术在基因药物递送领域中具有广泛应用,引起人们的高度重视[4]。 纳米材料作为基因载体具有以下优势:1)制备简单,易于合成;2)尺寸较小,易穿过生物体的组织间隙;3)易于多功能修饰,提高生物相容性,降低机体免疫反应,达到更高的表达效率。 本文对基于脂质体的纳米基因载体的应用及发展进行综述。
脂质体(liposomes)作为代表性载体,广泛应用于药剂学[5,6,7]、物理学[8,9]、化学[10]等领域。 1965年,英国Bangham[11]通过电子显微镜观察溶于水中的磷脂时发现了脂质体的存在,1968年由Sessa正式提出名词“liposomes”[12]。
脂质体是一种人工膜,膜壁厚度5~7 nm,直径在25~500 nm之间[13],具有良好的生物相容性。 当磷脂高温溶解在水中,分子的疏水尾部汇聚到一起伸向空气,而亲水头部就会插入水相,经过搅动后形成具有双分子层结构的封闭囊泡(vesicles),在囊泡内可以包裹多种不同极性的药物,进而促进极性大分子穿透细胞膜[14]。 脂质体结构如图1所示。 制备脂质体的双层膜材料可以是在水中自发组装成双分子层的磷脂,也可以是混合后经过搅动形成双分子层的磷脂,这些磷脂主要分为天然磷脂(PC)和合成磷脂(PE)。 目前,制备脂质体应用较多的磷脂是卵磷脂和胆固醇[15]。
 | 图1 形成脂质体的结构示意图Fig.1 Schematic structure of liposome |
脂质体本身具有很多的优良性质,包括良好的组织相容性和细胞亲和性等。 因脂质体类似于生物结构,对正常组织和细胞并无抑制作用和巨大损伤,并可长期存在于目标细胞的周围,使目的基因能够充分渗入到目标物中。 脂质体也可被溶酶体消化使药物自然释放,同时还具有给药途径快速方便、透皮吸收效率高、降低药物毒性、提高药物稳定性等优点[16],是生物领域中的重要材料,为我们的生活带来巨大改变。
脂质体纳米载体是一种新型有效的基因递送系统,提高治疗基因到达靶点处的效率,减少正常器官中的非特异性扩散,并易于对其进行合理修饰[17,18,19]。 脂质体与纳米材料结合后,可以携带质粒DNA,其原理是:分子结构中存在大量受pH影响产生质子化的氨基,这些氨基可以中和质粒DNA表面的负电荷,使DNA结构被压缩和包附形成相对较小的质粒DNA,通过纳米脂质体材料将DNA包裹在内部,避免受到核酸酶的降解[20]。 经过长期的发展和研究,到目前为止,新型脂质体纳米基因载体的构建逐渐成熟。 有许多脂质体与纳米粒子结合作为基因载体的例子,例如磁纳米脂质体基因载体、金纳米脂质体基因载体、量子点脂质体基因载体、壳聚糖脂质体基因载体、上转换脂质体纳米基因载体、石墨烯脂质体纳米基因载体等。 下面针对这几种纳米材料与脂质体结合的载体进行简要的概括。
磁性纳米材料与脂质体的复合物作为载体,在癌症治疗和基因递送方面发挥着重要作用。 磁纳米材料在脂质体协助下更容易通过与细胞膜和内涵体膜融合实现基因转染,同时减少磁性材料对生物体的副作用;磁性材料在磁场的作用下提高基因与细胞膜接触的机率,增加胞吞的速率,进而提升材料的转染效率。 Namiki等[21]利用油酸与脂质体混合物(DC-6-14、DOPE)形成包裹磁铁矿纳米晶体(LipoMag)的外壳,可将siRNA输送到小鼠的肿瘤部位,它与市售聚合物包裹的磁性纳米晶体(PolyMag)相比具有更高的核酸递送效率。 Holzbach等[22]通过磁性纳米粒子、阳离子脂质体和血管内皮生长因子(VEGF)基因组合在一起制备的全氟丙烷填充的“磁泡(magnetobubbles)”,将VEGF基因高效地转染到大鼠体内缺血皮瓣组织。 Pan等[23]首先将聚乙二醇(PEG)与磁性纳米脂质体相互融合后吸附DNA,再与转铁蛋白通过静电作用结合,制备出新型的阳离子脂质体与磁性纳米粒子的综合体,并将其作为基因递送的载体。 Heun等[24]用二棕榈酰磷酸胆碱(DPPC)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)包裹的磁性氧化硅膜纳米微泡材料,吸附带有绿色荧光蛋白的慢性病毒颗粒(pCHIV.eGFP)并将其递送到血管原代内皮细胞,与聚乙烯亚胺(PEI)包裹的脂质体磁性纳米材料相比具有更高的转染效率。 在体内注射实验中,实现了高度有效的特异性慢病毒转基因表达,建立的这种新型脂质体磁性纳米技术,在定点血管基因治疗方面具有很大的应用潜力。
磁性纳米材料与脂质体的复合物中,当磁性纳米颗粒直径小于30 nm时具有超顺磁性,超顺磁纳米脂质体材料在外加磁场作用下产生良好的靶向基因递送效果,在很微弱的磁场作用下也可以产生强磁场效应[25]。 超顺磁性纳米脂质体也具有生物相容性良好、组织穿透力强、体内循环时间长等优点,还可作为有前途的磁共振成像(MRI)造影剂[26],显示出良好的应用前景。 钆元素颗粒物作为磁性纳米材料不仅具有传递基因的功能,还可作为造影剂而广泛使用。 Oliver等[27]制造了一种含有脂质钆(Gd-DOTA-Chol)的MRI造影剂磁性材料,这种脂质体-钆可作为将质粒DNA转运入细胞的有效载体,显示了基因疗法的分子成像潜力。 Luo等[28]通过将3-(二环癸氨基丙基)苯-1,3,5-三酰胺(TT3)、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2000)、胆固醇(Chol)、1,2-二油酰基甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和二亚乙基三胺五乙酸-双硬脂酰胺-钆盐(Gd-DTPA-BSA)按照最佳摩尔比形成类脂超顺磁纳米粒子作为基因递送载体,在细胞中递送含有增强绿色荧光蛋白的mRNA,通过成像观察到细胞内部有明显的绿色荧光产生,并且在磁场下可观察到更明亮的荧光图像(合成机理图如图2所示)。
 | 图2 双功能TT3脂质纳米颗粒的示意图封装mRNA和Gd-DTPA-BSA[28]Fig.2 Schematic illustration of dual-functional TT3 lipid-like nano-particles. TT3 LLNs are able to efficiently encapsulate both mRNA and Gd-DTPA-BSA[28] |
虽然磁性脂质体纳米粒子具有良好的靶向能力,但由于其制备工艺繁琐,并不能在医学领域得到广泛应用。
金纳米脂质体复合材料生物相容性好,具有良好的物理性质与化学性质,在靶向给药、肿瘤光热治疗、基因传递等领域展现出广阔的应用前景。 金纳米从结构上分为金纳米球、金纳米星、金纳米棒、金纳米笼等,由于其制备工艺简单受到人们的青睐。 金纳米脂质体复合物作为载体,也是当今被广泛研究的纳米材料。 我们小组近年来对于脂质体金纳米作为基因载体进行了一系列研究。
Wang等[29]用硼氢化钠还原氯金酸的方法,以阳离子脂质体双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)作为保护剂,在室温搅拌条件下,合成了脂质双层保护的金纳米颗粒(DODAB-AuNPs),可以递送质粒DNA到人体肾脏上皮细胞(HEK293)。 实验结果显示,转染效率比单纯阳离子脂质体提高了4倍,已经达到了商品化脂质体(Lipotap)的效率。 为了提升转染效率,Wang等[30]又在原有脂质体金纳米基因载体的体系中引入了抗癌药物分子-诺考达唑(Nocodazole,NCZ),NCZ在细胞中可使细胞的骨架—微管结构分散,延长了DODAB-AuNPS复合物运送到溶酶体的时间,使大量的质粒DNA用充足的时间从内涵体中释放到细胞质中而最终到达细胞核得以转录。
作为基因载体的脂质金纳米颗粒由于其基因转染效率高和细胞毒性低而引起了关注。 Wang等[31]又将靶向癌细胞的小分子-叶酸(Folic acid,FA)修饰到所合成的纳米基因载体上,合成了可以有效到达癌细胞的GDD-FA纳米基因载体(如图3所示)。 通过在不同细胞中的对比,GDD-FA/DNA在肺癌细胞(A549,叶酸受体阴性细胞)中的转染效率较低;而在乳腺癌细胞中(MCF-7,叶酸受体阳性细胞)中,修饰有2.5%叶酸的脂质体金纳米基因载体的转染效率可高达85%。 并且裸鼠体内转染实验也获得了类似的结果。 此外,处理后的裸鼠主要组织器官并无明显的损伤。 因此,上述载体材料具有较高的靶细胞识别能力和转染效率及较低的细胞与组织毒性,有利于其在过表达叶酸受体的肿瘤细胞上实现基因治疗。
 | 图3 制备GDD-FA/DNA和GDD-FA-RhB/DNA复合物的示意图(A)及GDD-FA/DNA的体外和体内转染应用的示意图(B)[31]Fig.3 Schematic illustration for preparing the complexes of GDD-FA/DNA and GDD-FA-RhB/DNA(A) and schematic transfection application of GDD-FA/DNA in vitro and in vivo(B)[31] |
由于金纳米脂质体在体内不容易降解,在短时间内并无副作用,但长期存在于人体中,毒性仍未可知,因此限制了其在临床上的广泛应用。
量子点(Quantum Dots,QDs)作为荧光半导体纳米晶体(nanocrystals)[32]与脂质体融合具有诸多优势:量子点脂质体纳米材料改善了量子点的生物相容性,降低了其原本的生物毒性,保留了量子点本身荧光效率高、稳定性好、尺寸可调等特点,同时具有良好的生物相容性和抗降解能力,特别适用于长时间的检测和生物体内的运输。 因此,利用量子点脂质体复合物作为基因载体在生物医学领域得到了广泛的关注。
Shao等[33]合成的CdSeTe/ZnS量子点,用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 N-( N', N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-chol)、DSPE-PEG2000连接叶酸作为脂质体保护层,有效地将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因成功运送到肝癌细胞HepG2,且材料毒性相对较小。 Kim等[34]利用 O, O-二肉豆蔻基- N-赖氨酰谷氨酸盐(DMKE)、胆固醇、DSPE-mPEG2000和CdSe/ZnS量子点合成的阳离子混合物(Apt-QLs),可吸附带有绿色荧光探针的小干扰FITC-siRNA,并在外部修饰表皮生长因子抗体(anti-EGFR)。 复合物可以特异性地识别乳腺癌细胞MDA-MB-231上过表达的表皮生长因子,并通过荧光成像观察到小干扰RNA被成功递送到癌细胞中,靶基因表达的抑制率可达到80%。 合成机理图如图4所示。
 | 图4 Apt-QLs的合成示意图。将含有量子点(Q-dots)的阳离子DMKE脂质体与siRNAs(QLs)复合,然后将修饰适配体的DSPE-PEG2000插入得到Apt-QLs[34]Fig.4 Synthesis of Apt-QLs. Cationic DMKE liposomes containing Q-dots were complexed with siRNAs(QLs), and the aptamer and DSPEPEG2000-Mal conjugates were then inserted into the QLs(Apt-QLs)[34] |
量子点自身具有可追踪性强的特点,进一步提高量子点与脂质体复合物生物安全性,可促进其生物医学领域中应用。
壳聚糖与脂质体的融合颗粒作为有机纳米基因载体的典型代表,在生物领域得到了长足发展。 90年代后期,在寻找新型非病毒载体期间,由于壳聚糖具有亲水性好、可生物降解等优势得以脱颖而出[35]。 壳聚糖脂质体纳米材料作为基因载体具有以下优势:1)壳聚糖的分解物无毒,并且加入脂质体进一步增加了材料生物相容性;2)带有正电荷的壳聚糖与脂质体结合后的纳米粒子,通过静电作用可以吸附带有负电荷的DNA;3)靶向性分子极易与壳聚糖脂质体纳米粒子结合,可有效进入靶细胞并释放目的基因[36]。 先前开发的大部分脂质/壳聚糖体系粒径为200~300 nm[35],现如今,研究人员所合成粒径较小的壳聚糖脂质体纳米粒子作为基因载体具有更加广阔的应用空间。
Tezgel等[37]采用一步法合成脂质壳聚糖纳米粒子(CS-LNPs),其粒径小于120 nm,Zeta电势高于+40 mV,颗粒外壳包括大豆卵磷脂、 N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]- N, N, N-三甲基铵甲基-硫酸盐(DOTAP)、DOPE和不同相对分子质量的两亲壳聚糖。 通过实验得出相对分子质量为1.5×104的壳聚糖复合的脂质体纳米基因载体可以更有效地将siRNA递送到小鼠纤维细胞NIH3T3 cell中,并且具有材料制备简单、转染率高等优点。 Baghdan等[36]采用DPPC/Cholesterol组成的磷脂双层膜包封壳聚糖纳米粒子,加入交联剂三聚磷酸钠(TPP),粒径接近100 nm,将质粒DNA运送到人胚胎肾细胞(HEK-293)中,与传统的聚合物PEI壳聚糖载体相比,有着较高的基因表达效果。 通过溶血试验证实,在绒毛尿囊膜中注射该材料,绒毛尿囊部位没有坏死。 用壳聚糖脂质体纳米粒子转染GFP的结果证明,基于壳聚糖脂质体的纳米载体可以在生理条件成功完成基因的递送(递送机理如图5所示)。
将壳聚糖改性为甲壳低聚糖,有利于生物体的消化吸收,甲壳低聚糖与脂质体相互结合更易在体内降解,并且有利于高效率传递目标基因和有效抑制癌细胞的生长。 因此,利用先进技术制备甲壳低聚糖,对实现壳聚糖脂质体复合物作为高效的基因载体具有重大意义。
上转换脂质体纳米材料作为基因载体,是生物领域的新型材料,其性质主要取决于上转换纳米材料(UCNPs)。 近年来上转换纳米材料的研究日益增多,而对于上转换脂质体纳米材料的研究却屈指可数。UCNPs在生物学应用中具有诸多优势,如近红外辐射对组织几乎无损伤,具有较深的激光穿透深度,生物组织无背景荧光等[38]。 但是UCNPs的广泛应用仍然受到生物相容性差和毒性大的限制[39]。 为增强 UCNPs的生物相容性和稳定性,通过与脂质体的相互结合,可以得到合成方便、低免疫应答以及良好安全性的新功能上转换脂质体纳米材料。
Song等[40]利用YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O和ErCl3·6H2O与油酸通过溶剂热方法形成上转换纳米粒子,并利用短肽修饰的阳离子脂质体CDO14进行包封,得到基于靶向肽修饰的上转换阳离子脂质体材料。 通过肺癌细胞A549细胞的基因沉默实验和毒性试验证实了该材料能够有效地传递siRNA,并具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性(基因传递过程如图6所示)。
虽然上转换纳米材料被脂质体包裹之后降低了本身的毒性,但是材料在体内不易降解,降低了其在生物领域中实用价值。 因此,研究上转换纳米材料作为基因载体较少。
石墨烯脂质体纳米材料是基因载体的新星。由于脂质体易于修饰,且具有较好的生物相容性,与石墨烯相互结合可充分发挥石墨烯自身的优势,例如表面积大、导热和导电性良好、易于表面官能化、可携带活性剂并靶向特定组织等。 石墨烯脂质体纳米材料是一种具有良好发展前景的基因/药物递送平台[41,42],为制备基因载体提供了新思路。 如今,研究者已对石墨烯脂质体复合材料作为基因载体进行深入的探索。
Imani等[43]利用磷脂的聚合物(PL-PEG)和细胞穿透肽(CPP)来改进基于石墨烯氧化物(GO)纳米载体的稳定性和siRNA转染能力。 载有siRNA的纳米载体在MCF-7细胞溶液中保持稳定,表现出良好的细胞相容性和高效率递送基因的能力(如图7所示)。
尽管石墨烯脂质体纳米材料在递送siRNA中具有较好的应用前景,但是载体材料用于生物体内的效果仍难以预测。 在后续研究中,应考察石墨烯脂质体纳米材料在生物体内的状态以及排出过程,为其在生物医学领域的应用提供一定的指导。
目前,科学技术的发展促进了脂质体纳米材料复合物作为基因载体的研究。 脂质体与纳米材料的复合物具有功能多样、生物相容性好、易于表面修饰等优点[44,45],使其在基因载体领域中得到迅速发展。 然而,由于部分脂质体纳米基因载体还存在粒径过大,不易被细胞吸收导致转染效率低,或者生物相容性差等缺点而限制了其在生物和医学领域的应用。 为增强脂质体纳米复合材料的转染效率,可以采用多种策略来开发基因递送平台,例如多组分纳米材料的扦插,减小材料的粒径;在脂质体纳米复合材料的表面修饰靶向性的配体,增加脂质体纳米复合材料对靶细胞的识别作用等。 在提高基因载体的生物相容性方面,可在载体合成过程中尽量选择生物可降解或者无毒的材料。 随着新型纳米材料的研发日益增多,基于脂质体纳米材料的基因递送系统必将有更加广阔的发展空间。
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