引用本文
蔡其洪, 陈小萍, 鲁家兴, 陈登秀. 荧光法快速测定奶粉中3种雌激素的总量[J]. 应用化学, 35(5): 609-612
CAI Qihong, CHEN Xiaoping, LU Jiaxing, et al. Rapid Determination of Total Amount of Three Estrogens in Milk Powder by Fluorescence Spectrometry[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 35(5): 609-612  
Permissions
Copyright©2018, 应用化学编辑部
本文属于开放获取期刊，遵循CCAL协议，使用请注明出处。
荧光法快速测定奶粉中3种雌激素的总量
蔡其洪*, 陈小萍, 鲁家兴, 陈登秀
莆田学院药学与医学技术学院,药物分析与检验医学福建省高校重点实验室 福建 莆田351100
通讯联系人:蔡其洪,教授; Tel/Fax:0594-2787689; E-mail:cqh118@163.com; 研究方向:分子发光分析
收稿日期:2017-06-15 修回日期:2017-08-07 接受日期:2017-09-04
基金:福建省科技计划引导性项目(2015Y0030);福建省教育厅科技项目(JK2014045);莆田市科技计划项目[2013S01(2)];莆田学院科研项目(2015088); 福建省科技计划引导性项目(2015Y0030);福建省教育厅科技项目(JK2014045);莆田市科技计划项目[2013S01(2)];莆田学院科研项目(2015088);
摘要

基于3种雌激素(雌二醇、雌三醇和炔雌醇)相似的荧光性质,建立起荧光法直接快速测定奶粉中3种雌激素的总量。 以雌三醇为标准参考物质,采用标准曲线法测定。 雌三醇的荧光强度与浓度在1~2000 nmol/L的范围内呈线性关系,方法的检出限为0.16 nmol/L,回收率在89.11%~98.49%之间。 该方法简单、快速、线性范围宽、准确度和灵敏度高。 用于实际奶粉中3种雌激素总量的测定,结果满意。

关键词: 雌激素; 荧光分析法; 奶粉; 雌二醇; 雌三醇; 炔雌醇
中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2018)05-0609-04
Rapid Determination of Total Amount of Three Estrogens in Milk Powder by Fluorescence Spectrometry
CAI Qihong, CHEN Xiaoping, LU Jiaxing, CHEN Dengxiu
Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis and Laboratory Medicine of Fujian Province University, Pharmaceutical and Medical Technology College,Putian University,Putian,Fujian 351100,China
Corresponding author:CAI Qihong, professor; Tel/Fax:0594-2787689; E-mail:cqh118@163.com; Research interests:molecular luminescence analysis
Received:2017-06-15 Revised:2017-08-07 Accepted:2017-09-04
Fund:Supported by the Leading Project of Fujian Provincial Science and Technology Program(No.2015Y0030), the Scientific Research Project of the Education Departerment of Fujian Province(No.JK2014045), the Science and Technology Project of Putian City[No.2013S01(2)], the Scientific Research Project of Putian University(No.2015088)
Abstract

Based on the similarity of the fluorescence properties of three estrogens, a new fluorescence method for direct determination of the total amount of three estrogens(estradiol, estriol, ethinyloestradiol) in milk powder was developed. Taking estriol as the standard reference material, the standard curve method was adopted. The fluorescence intensity of estriol has a linear relationship with the concentration in the range of 1.00~2000 nmol/L and the detection limit of 0.16 nmol/L. The recovery is in the range of 89.11%~98.49%. This method is simple, rapid, highly accurate and sensitive and has been successfully applied to determine the total estrogens in milk powder with satisfactory results.

Keyword: estrogens; fluorescence spectrometry; milk powder; estradiol; estriol; ethinyloestradiol

乳品是人类重要的食品之一,因此乳品质量安全问题备受关注。 而如今为了提高牛奶的产量,有些奶农会给奶牛喂养含动物蛋白的高蛋白饲料,注射激素催奶剂,人工诱导奶牛泌乳,这些均会导致牛奶中雌激素的含量增加。 雌激素属于甾体类激素,作为内分泌干扰物之一,长期摄入会导致性早熟、妇女乳腺癌和子宫癌、男性前列腺癌、抑制骨骼和精子发育等[1,2,3,4,5];1996年,欧盟通过欧洲共同体委员会指令96/22/EC禁止使用具有促生长作用的激素,我国农业部公告第235号也作了具体的规定。

目前,乳品中雌激素的检测方法主要采用高效液相色谱法[6,7,8]、气相色谱-质谱法[9,10]和液相色谱-质谱法[11,12]进行测定。 其中雌二醇 、雌三醇和炔雌醇为乳品中雌激素的常规检测项目,一般进行如下4个步骤:样品提取、富集净化、分离和测定。 由于这些方法均需复杂、烦琐的前处理操作,分析时间长,难以进行快速检测,而且仪器价格相对比较昂贵,一般基层实验室难于开展此项工作。 目前,荧光分析法直接测定奶粉中这3种雌激素未见文献报道,实验所建立的荧光法只需对奶粉进行简单的处理就可进行检测,且荧光仪器价格适中,操作简便,因此荧光法直接测定奶粉中雌激素的建立,可实现快速、准确测定奶粉中的雌激素,节省实验所需的时间,降低分析检测成本和费用。 另外,由于荧光法灵敏度高,可实现痕量物质的分析检测,这对严格监控奶粉中雌激素的残留量,评价奶粉质量安全,保障人类身体健康具有重要的意义。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

F-4600型荧光仪(日本日立公司);KUDOS超声仪(上海科导超声仪器有限公司);TGL-15B型离心机(上海安亭科学仪器厂);CP124C万分之一电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)。

奶粉由市场随机购买,雌二醇(99.0%)、雌三醇(99.5%)和炔雌醇(99.5%)均购自德国Dr公司;乙腈(德国Merck公司,色谱纯,99.9%);甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯和环己烷均为分析纯试剂,购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取雌二醇、雌三醇和炔雌醇标准品适量,以乙腈为溶剂,配制它们的标准溶液浓度皆为0.5 mmol/L,于4 ℃冰箱冷藏备用,根据实际需要再逐级稀释。

1.2.2 测定方法

取一定量的待测溶液于1 cm×1 cm的石英比色皿中,设置荧光仪器的激发和发射单色器狭缝宽度均为5 nm,扫描速度为240 nm/min,然后进行荧光光谱测定。

1.2.3 奶粉测定

称取1 g的各种品牌奶粉于10 mL刻度试管中,加3 mL乙腈,振荡均匀,于超声仪上超声10 min,10000 r/min的离心机上离心10 min,取上清液,0.45 μm微孔滤膜过滤,重复3次,合并滤液,并定容至10 mL,分别在荧光仪上测定。

2 结果与讨论
2.1 溶剂的选择

奶粉中富含蛋白质,而蛋白质具有很强的荧光性质,对实验的干扰大。 实验选择了甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯及环己烷等不同溶剂进行比较,结果发现,除乙腈溶剂对奶粉提取后溶液呈澄清状,样品基体的干扰少,其它溶剂提取液都呈浑浊状,实验干扰大,这主要是由于乙腈具有沉淀蛋白质的作用,故本实验选择乙腈作为溶剂。

2.2 3种雌激素的荧光激发和发射光谱

配制1 μmol/L 3种雌激素,分别扫描它们各自的荧光激发和发射光谱,结果见图1。

图1 雌二醇(实线)、雌三醇(间断线) 和炔雌醇(点线)的荧光激发和发射光谱Fig.1 Excitation and emission spectra of estradiol(solid line), estriol(dash line) and ethinyloestradiol(dot line)

从图1中可以看出,3种雌激素的荧光激发和发射光谱波长位置为 λex=202、223和280 nm, λem=306 nm,3种雌激素光谱的形状和峰位置基本一致,其中最大的荧光激发和发射光谱波长位置在 λex=202 nm, λem=306 nm。 主要原因是3种雌激素的母体为甾体结构,如图2所示,其荧光性质主要由甾体结构决定,故它们的荧光性质存在一致性。

图2 雌二醇、雌三醇和炔雌醇的化学结构式Fig.2 Chemical structures of estradiol, estriol and ethinyloestradiol

2.3 标准工作曲线和检出限

由于相同物质的量浓度3种雌激素的荧光强度几乎一致,因此我们选择雌三醇作为测定的标准参考物质。 配制一系列不同浓度的雌三醇溶液,按照实验所选定的方法进行荧光测定。

以荧光强度对雌三醇浓度作标准工作曲线,结果如图3所示。 雌三醇的浓度在1~2000 nmol/L范围内荧光强度与浓度呈良好的线性关系,其线性方程为 F=4.8 c+188.2,相关系数 R=0.9990,方法检出限为0.16 nmol/L( D=3 S/K, D为方法检出限, S为11次空白测定值的标准偏差, K为线性方程的斜率)。

图3 雌三醇标准工作曲线Fig.3 Calibration curve of estriol

2.4 精密度实验

平行配制相同浓度600 nmol/L的雌三醇溶液6份,按上述所设定的实验方法进行荧光强度测定,计算得雌三醇的相对标准偏差(RSD)为1.8%。说明该实验方法的精密度好。

2.5 回收率实验

设计加标回收实验,以验证新方法测定结果的准确度。取含有雌激素的奶粉1 g于10 mL刻度试管中,加入不同量的标准品雌三醇后,按1.3.3节步骤进行实验操作,后荧光法测定,结果见表1。 雌三醇的回收率在89.11%~98.49%之间,回收效果好。

表1 雌三醇回收率实验 Table 1 Recovery of estriol
2.6 实际奶粉的测定

随机购买流通市场不同品牌的奶粉20份,按1.3.3节实验步骤进行荧光法测定,每份平行测定3次。 其中13份样品中检出含有的该3种雌激素的总量,检出率为65.5%。

表2 实际奶粉中雌激素测定结果 Table 2 The results of estrogen contents determination of milk powder
3 结 论

实验所建立奶粉中雌二醇、雌三醇和炔雌醇3种雌激素总量测定的荧光分析新方法具有高准确度、高灵敏度和高选择性等特点,且实验测定简单、快速、费用低廉,完全可以满足奶粉中3种雌激素的常规检测。

参考文献
[1] Armstrong B, Doll R. Environmental Factors and Cancer Incidenceandmortality in Different Countries, with Special Reference to Dietary Practices[J]. Int J Cancer, 1975, 15(4): 617-631. [本文引用:1]
[2] Rose D P, Boyar A P, Wynder E L. International Comparisons of Mortality Rates for Cancer of the Breast, Ovary, Prostate, and Colon, and Per Capita Food Consumption[J]. Cancer, 1986, 58(11): 2363-2371. [本文引用:1]
[3] Qin L Q, Wang P Y, Kaneko T, et al. Estrogen: One of the Risk Factors in Milk for Prostate Cancer[J]. Med Hypoth, 2004, 62(1): 133-142. [本文引用:1]
[4] YUAN Lijun, XU Zhuangjian, XU Xiangsheng. The Estrogen in Cow's Milk and Its Safety[J]. Int J Inter Med, 2007, 34(4): 712-714(in Chinese).
袁丽君, 徐庄剑, 许祥生. 牛奶中的雌激素及其安全性[J]. 国际内科学杂志, 2007, 34(4): 712-714. [本文引用:1]
[5] Kaipparettu B A, Malik S, Konduri S D, et al. Estrogenmediated Downregulation of CD24 in Breast Cancer Cells[J]. Int J Cancer, 2008, 123(1): 66-72. [本文引用:1]
[6] Wang L, Yan H Y, Yang C L, et al. Synthesis of Mimic Molecularly Imprinted Ordered Mesoporous Silica Adsorbent by Thermally Reversible Semicovalent Approach for Pipette-Tip Solid-Phase Extraction-Liquid Chromatography Fluorescence Determination of Estradiol in Milk[J]. J Chromatogr A, 2016, 1456(1): 58-67. [本文引用:1]
[7] Xiao X H, Yin Y, Hu Y L, et al. Microwave-Assisted Extraction Coupled with Single Drop Microextraction and High-Performance Column Liquid Chromatography for the Determination of Trace Estrogen Adulterants in Soybean Isoflavone Dietary Supplements[J]. J AOAC Int, 2010, 93(3): 849-854. [本文引用:1]
[8] XIAO Fugang, GUO Weiyun, LIU Yan, et al. Determination of Estradiol in Milk Powder by HPLC[J]. Food Res Dev, 2011, 32(8): 81-83(in Chinese).
肖付刚, 郭卫芸, 刘燕, 等. 奶粉中雌二醇的高效液相色谱法检测[J]. 食品研究与开发, 2011, 32(8): 81-83. [本文引用:1]
[9] ZHANG Hongying, ZHANG Hong, WANG Shuhui, et al. Determination of Environmental Estrogens in Milk by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Chinese J Health Lab Technol, 2007, 17(6): 1139-1140(in Chinese).
张红英, 张宏, 王淑惠, 等. 气相色谱-质谱法测定牛奶中的8种环境雌激素和内源性雌激素[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(8): 1713-1715. [本文引用:1]
[10] LIU Yonglin, TIAN Chengxin, YAN Tianwen, et al. Determination of β-Estradiol in Bovine Colostrum by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. China Dairy Ind. , 2014, 42(7): 53/54/55, 59(in Chinese).
刘泳麟, 田成新, 闫天文, 等. 气相色谱-质谱法检测牛初乳中 β-雌二醇的研究[J]. 中国乳品工业, 2014, 42(7)): 53/54/55, 59. [本文引用:1]
[11] Tso J, Aga D S. A Systematic Investigation to Optimize Simultaneous Extraction and liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Analysis of Estrogens and Their Conjugated Metabolites in Milk[J]. J Chromatogr A, 2010, 1217(29): 4784-4795. [本文引用:1]
[12] Yang Y, Shao B, Zhang J, et al. Determination of the Residues of 50 Anabolic Hormones in Muscle, Milk and Liver by Very-High-Pressure Liquid Chromatodraphy-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2009, 877(5/6): 489-496. [本文引用:1]