引用本文
王玉鹏, 周东方, 程延祥, 黄宇彬. 血红蛋白/光敏剂复合药物体系用于光动力治疗[J]. 应用化学, 35(12): 1442-1448
WANG Yupeng, ZHOU Dongfang, CHENG Yanxiang, et al. Hemoglobin/Photosensitizer Compound Drug System for Photodynamic Therapy[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 35(12): 1442-1448  
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血红蛋白/光敏剂复合药物体系用于光动力治疗
王玉鹏a,b, 周东方a, 程延祥a, 黄宇彬a,*
a中国科学院长春应用化学研究所,高分子物理与化学国家重点实验室 长春 130022
b中国科学院大学 北京 100039
通讯联系人:黄宇彬,研究员; Tel/Fax:0431-85262769; E-mail:ybhuang@ciac.ac.cn; 研究方向:生物医用高分子
收稿日期:2018-04-08 修回日期:2018-04-23 接受日期:2018-06-06
基金:国家自然基金(51673188)项目资助;
摘要

通过等电点法实现了血红蛋白(Hb)与光敏剂药物七甲川花菁类小分子:11-氯-1,1'-二正丙基-3,3,3',3'-四甲基-10,12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐(IR780)的共担载,并研究了Hb供氧治疗与光动力治疗的联合治疗效果。 通过透射电子显微镜和动态光散射研究了Hb/IR780复合药物载体的形貌与稳定性,证明了药物载体在生理条件下能够稳定存在。 通过对药物在体外溶液和细胞水平的活性氧(ROS)检测,验证了Hb供氧能够有效地促进光敏剂ROS的产生,并且细胞毒性实验也证实了Hb/IR780复合药物载体拥有比单组份IR780药物更明显的肿瘤细胞杀伤效果。

关键词: 血红蛋白; 光动力治疗; 氧气治疗
中图分类号:O636 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2018)12-1442-07
Hemoglobin/Photosensitizer Compound Drug System for Photodynamic Therapy
WANG Yupenga,b, ZHOU Dongfanga, CHENG Yanxianga, HUANG Yubina
a State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry,Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130022,China
b Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039,China
Corresponding author:HUANG Yubin, professor; Tel/Fax:0431-85262769; E-mail:ybhuang@ciac.ac.cn; Research interests:biomedical polymer
Received:2018-04-08 Revised:2018-04-23 Accepted:2018-06-06
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.51673188);
Abstract

In this paper, the loading of both hemoglobin and photosensitizer drug heptamethine cyanine fluorescent small molecule:11-chloro-1,1'-di- n-propyl-3,3,3',3'-tetramethyl-10,12-trimethylene quinone three-carbon cyanine iodide salt(IR780) was achieved by the isoelectric point method. The effect of the combined treatment of hemoglobin oxygen therapy and photodynamic therapy was studied. The morphology and stability of the hemoglobin/IR780 complex drug carrier were studied by transmission electron microscopy and dynamic light scattering, proving that the drug carrier maintains good stability under physiological conditions. The reactive oxygen species(ROS) detection of the drug in the solution and cell confirmed that the oxygen supply of hemoglobin could promote the production of ROS effectively. Meanwhile, it was also confirmed that the hemoglobin/IR780 complex drug carrier was more efficient to kill tumor cells than the single component IR780 drug in cell cytotoxicity experiments.

Keyword: hemoglobin; photodynamic therapy; oxygen therapy

在过去的几十年中,光动力疗法(PDT)已经成为癌症治疗中一种颇受关注的非创伤性治疗手段。 其作用机理是在特定波长的光照条件下,光敏剂通过一系列光化学和光生物学反应,在分子氧的参与下,产生单线态氧(singlet oxygen)和/或自由基(均属于活性氧(ROS)),氧化破坏组织和细胞中的各种生物大分子,使异常增生活跃的细胞发生不可逆的损伤,最终使细胞死亡,达到治疗目的[1,2,3]。 但是,PDT在临床应用上仍然存在很多的问题,例如光敏剂必须在治疗部位达到一定的蓄积量,才能够产生足够的单线态氧,从而起到治疗作用[4];肿瘤组织缺氧微环境使PDT的氧分子参与严重不足,限制了光敏剂的应用[5]。 氧气治疗则成为解决PDT治疗难题的重要手段。 Cheng等[6]利用脂质体载体同时担载光敏剂药物七甲川花菁类小分子:11-氯-1,1'-二正丙基-3,3,3',3'-四甲基-10,12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐(IR780)和氧气供应分子全氟化碳,并在细胞和动物水平验证了全氟化碳的供氧功能能够有效地促进PDT效果,提高肿瘤杀伤率。 氧气治疗与PDT的联合治疗受到越来越多的关注[7,8]。

血红蛋白(Hb)是一种研究最多的呼吸蛋白,它是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质,能结合氧气分子(1 g Hb能结合1.39 mL O2),并被血液运输。 作为一种天然的载氧蛋白,Hb被广泛地应用于肿瘤的缺氧改善治疗之中[9]。 早在1984年,科学家就尝试在肿瘤放化疗过程中,通过对肿瘤脉管系统进行全血灌注的方法,增加红细胞对肿瘤组织的供氧,从而增加放化疗效果。 但是作为亲水性大分子,Hb很难与常见的疏水光敏剂药物被载体共同担载,从而限制了Hb在PDT中的应用,如何有效地将Hb与光敏剂药物相结合从而促进PDT是急需解决的科研难题[10,11]。

本文利用等电点法,将溶液中的Hb转变为疏水蛋白,以期实现对Hb与光敏剂药物IR780的共担载。 并在溶液和细胞水平考察了Hb-IR780复合药物载体的PDT效果,证明了Hb能够通过供氧有效地促进PDT对肿瘤细胞的杀伤作用。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器

牛血红蛋白(99%)、IR-780碘化物(98%)、PEG2k- b-PCL5k(99%)、1,3-二苯基异苯并吡喃(DPBF,97%)和噻唑蓝(MTT,98%)均购于西格玛公司。

JEM-1011型透射电子显微镜(TEM, 日本电子公司);Brookhaven 90Plus size analyzer型动态光散射仪器(DLS,美国布鲁克海文仪器公司);UV-2450PC型紫外可见光谱(UV-Vis,日本岛津公司);Olympus FV1000型激光共聚焦显微镜(CLSM,日本奥林巴斯公司);BioTeK ELX808 TM型酶标仪(美国Bio-tek公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质等电点的测定

配置不同pH值的PBS(磷酸盐缓冲溶液,pH值为5.00、5.40、6.10、6.40、6.60、6.75、7.00、7.25、7.45和8.00),取20 mg Hb分别溶于不同pH的PBS(5 mL)中,静置10 min。之后通过DLS测定Hb在室温时的Zeta电势。

1.2.2 等电点法制备载药蛋白质-聚合物复合纳米粒(Hb-NPs@IR780)

配置pH值等于Hb等电点的磷酸盐缓冲液(pH=6.7)。 称取1 mg IR780和10 mg共聚物材料(PEG2k- b-PCL5k)溶于5 mL DMF( N, N-二甲基甲酰胺),2 mL Hb溶液(0.9%NaCl,10 g/L)同时滴加到18 mL PBS中(0.02 mol/L,pH=6.7)。 有机相加入注射器中用注射泵滴加,水相用蠕动泵滴加,控制速度使两相同时滴完,混合液加入透析袋(Molecular Weight Cut Off(MWCO)=3500)中,对水透析2 d后用中空微滤管(HF membrane,MWCO=5.00×105)除去游离Hb,4 ℃储存备用。

作为对照,使用PEG2k- b-PCL5k通过胶束滴定法包裹小分子IR780,制备IR780纳米药物载体(8NPs@IR780)。

1.2.3 Hb-NPs@IR780的稳定性考察

将1 mL制备的Hb-NPs@IR780溶液分散在10 mL pH=7.4的缓冲溶液中,在预先设定的时间点(0、1、4、9和24 h)通过DLS测定纳米粒的粒径。 同时,对Hb-NPs@IR780在生理条件下的释放行为也进行了考察:取1 mL Hb-NPs@IR780溶液分散于3 mL PBS缓冲液(pH=7.4和pH=5.0)中,将上述溶液转移到截留相对分子质量为3500的透析袋中,然后将含有药物溶液的透析袋绑好,浸泡在装有20 mL相同pH值的缓冲溶液的棕色广口瓶中。 置于37 ℃振荡箱内开始振荡释放,振速为80 r/min。 每隔一定时间(1、3、6、9、12、24、48、60和72 h),取出1 mL透析液用于测试,并补加1 mL新鲜的缓冲溶液到广口瓶中以保持体系总体积不变。 IR780的释放量通过UV-Vis测定所取渗析液在780 nm的吸光度,并与IR780在相同缓冲液中的标准曲线比对得到。

1.2.4 载药蛋白纳米粒水溶液在光照下单线态氧检测

Hb-NPs@IR780和NPs@IR780在近红外光(808 nm)照射下活性氧的产生量可以通过DPBF作为指示剂检测。 将DPBF的DMF溶液以1：10体积比加入Hb-NPs@IR780和NPs@IR780的水溶液中,DPBF的质量浓度为10 mg/L,溶液体积为2.5 mL。 使用可以产生808 nm近红外光的光源照射溶液,功率为100 mW/cm2。 每隔10 s(共测定12次),测定溶液的紫外吸收光谱,并用410 nm处的吸光度值对光照时间作图。

1.2.5 细胞水平ROS检测

细胞水平通过DCFH-DA探针(即活性氧检测试剂盒检测)检测药物在光照刺激下产生的ROS。 将消化好的处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)按1×105 cells/well的密度接种到细胞板中,放入培养箱,贴壁培养24 h;待细胞贴壁完全后,将培养基吸出,分别加入含有Hb-NPs@IR780和小分子IR780的培养基溶液,IR780浓度一致:1 mg/L。 继续在黑暗条件下培养4 h后,将含有药物的培养基吸出。 待用PBS洗涤3次后,加入含有DCFH-DA的培养基继续培养20 min。 然后用PBS洗涤3次,加入培养基,给予近红外光照(808 nm,100 mW/cm2)2 min。 最后,用CLSM观察细胞ROS的产生情况,用488 nm通道激发,绿色荧光表示ROS产生。

1.2.6 细胞毒性实验

将100 μL不同药物浓度(IR780:0.078~5 mg/L)的小分子IR780和Hb-NPs@IR780培养基溶液分别与HepG2细胞在96孔板中共孵育4 h,然后将含有药物的培养基从96孔板中吸出,并换为新鲜的培养基溶液。 黑暗组:细胞继续培养48 h;光照组:每个96孔板均给予近红外光照(808 nm, 100 mW/cm2)5 min,待光照完后,将细胞放置培养箱中继续在黑暗条件下培养48 h。 将MTT溶液(5 g/L,PBS,pH=7.4)加入到各孔中,每孔20 μL,继续培养4 h,吸除培养基,加入150 μL DMSO(二甲基亚砜)溶解生成的蓝色晶体,10 min后用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度。各个复孔的光密度(OD)值取平均值作为样品的OD值,细胞存活率(CV)按照以下公式计算。

CV=OD1OD0×100%(1)

式中,CV为细胞存活率(Cell viability),OD1为样品组吸光值,OD0为对照组吸光值。

2 结果与讨论
2.1 等电点法制备载药蛋白质-聚合物复合纳米粒

在溶液中Hb以两性离子形式存在,在等电点时,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白分子因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小[12]。 利用蛋白的这一特性,尝试将Hb与疏水光敏剂IR780同时包裹进共聚物胶束的疏水内核中。 首先,通过Zeta电势法测定Hb的等电点,由图1A可知Hb在不同的pH值环境中拥有不同的表面电势,当pH=6.70左右时,其表面电势( ζ)为0,此时的蛋白质分子的净电荷为零,说明了Hb的等电点在pH=6.70左右。 之后,将共聚物/药物溶液和Hb溶液同时滴入pH为Hb等电点的水溶液中,通过PCL链段和Hb的疏水作用,形成包裹Hb和IR780的共聚物载药纳米粒(Hb-NPs@IR780)。 对Hb-NPs@IR780进行了TEM表征,如图1B、1C所示,纳米粒呈规则的球形形貌,粒径约200 nm并且拥有较低的分散指数(PDI=0.151)。 通过紫外光谱仪对两种载药纳米粒的光敏剂药物担载率进行测定,NPs@IR780:16.74%,Hb-NPs@IR780:15.19%,Hb的担载不影响IR780的担载效率。

图1 血红蛋白在不同pH值下的 ζ电势(A)、Hb-NPs@IR780的透射电子显微镜(TEM)照片(B)及粒径分布图(C)Fig.1 Zeta potential of native hemoglobin in different pH solutions(A), TEM image(B) and size distribution (C) of Hb-NPs@IR780

2.2 载药蛋白质-聚合物复合纳米粒的稳定性考察

PDT需要药物在肿瘤达到一定的蓄积量才能充分产生活性氧来杀伤癌细胞,所以为了提高药物的利用效率,要求载体在药物的传输过程中尽量减小药物的释放。 首先,在体外模拟生理条件(pH=7.4,37 ℃),考察了载药蛋白质胶束在体外粒径稳定性。 如图2A所示,Hb-NPs@IR780纳米粒在72 h内均保持了均一的粒径和较低的PDI,未出现纳米粒的聚集和解离情况。 之后,在模拟血液循环的较中性环境(pH=7.4)中考察了载药蛋白胶束的药物释放行为。 如图2B所示,在pH=7.4的条件下,Hb-NPs@IR780中的IR780释放相对缓慢,孵育72 h后仅有不到15%的IR780被释放到缓冲液中。 将释放实验后的Hb-NPs@IR780溶液进行TEM观察(图2C),纳米粒仍然保持了呈规则的球形形貌,粒径约200 nm。 上述结果均证明了制备的Hb-NPs@IR780纳米粒均拥有良好的结构稳定性,保证了药物在血液循环中不会过多泄露。

图2 Hb-NPs@IR780在生理条件下(pH=7.4,37 ℃)72 h内的粒径变化(A)和药物释放曲线(B)以及72 h后的纳米粒的TEM图(C)2.3 载药蛋白质-聚合物复合纳米粒PDT考察2.3.1 水溶液中光照下ROS的检测Fig.2 Size-stability(A), in vitro IR780 release(B) and TEM image(C) of Hb-NPs@IR780 after incubated in PBS 7.4 at 37 ℃ for 72 h

首先,对Hb-NPs@IR780纳米粒溶液的氧气释放进行考察,如图3A所示,在不断给Hb-NPs@IR780溶液中通入氮气排除溶液中氧气,从Hb的紫外特征吸收峰变化可以看出,Hb逐渐由氧合态转变

图3 Hb-NPs@IR780溶液在不同气体氛围中(A)、NPs@IR780(B)和Hb-NPs@IR780(C)溶液在808 nm光照下(100 mW/cm2)的UV-Vis谱图以及溶液中DPBF的相对吸光度值随时间的变化(D)。Fig.3 UV-Vis absorbance spectra of Hb-NPs@IR780 in different gas-binding states(A), NPs@IR780(B) and Hb-NPs@IR780(C) after each two minutes irradiation at 808 nm(100 mW/cm2). The change in the IR780 absorption at 780 nm over time with different solutions containing IR780 under irradiation(808 nm, 100 mW/cm2)(D)

为脱氧态,证明了在溶液缺氧的条件下,Hb会释放氧气。 之后,用DPBF 作为ROS的检测试剂,在体外检测Hb-NPs@IR780溶液在近红外光照条件下药物产生ROS的效率。图3B和3C分别为NPs@IR780溶液和Hb-NPs@IR780溶液在近红外光808 nm光照下的UV-Vis的变化。 从图3B和3C两图对比可以看出,随着光照时间的延长,Hb-NPs@IR780溶液在410 nm处的UV-Vis吸收值下降幅度最大,明显快于NPs@IR780溶液中410 nm处吸收值的下降速度。 记录并计算该吸收值与起始值的比例(Hb-NPs@IR780在计算时须减去未添加DPBF时Hb-NPs@IR780溶液在410 nm处的吸收峰值),并与时间作图,如图3D所示,光照2 min后,各组DPBF吸收值的减小值分别为:0.69(NPs@IR780溶液溶液)和0.95(Hb-NPs@IR780溶液)。 以上结果证明,光照过程中IR780不断消耗溶液中的氧气,溶液缺氧状态会影响1O2的产生,而Hb-NPs@IR780溶液中Hb能够在溶液缺氧状态下释放氧气,从而继续促进1O2的产生,提高光动力效果。

2.3.2 细胞水平ROS的产生

为了进一步检测药物在细胞中的ROS产生效果,使用细胞ROS检测试剂盒(DCF-DA)验证光照下两种药物在细胞内产生ROS的过程。DCF-DA可以快速结合细胞内ROS形成具有强荧光信号的DCF,从而验证细胞内ROS的产生。 如图4所示,黑暗条件下,NPs@IR780和Hb-NPs@IR780给药组细胞均只有微弱的ROS产生,而在对细胞进行近红外光照处理后,可以看到Hb-NPs@IR780给药组细胞内有很强的绿色荧光出现,说明细胞内产生了大量的ROS;而NPs@IR780给药组的绿光相对较弱,说明ROS产生量较少。 细胞水平ROS实验说明,被细胞内吞后,在光照条件下,IR780消耗细胞溶液中的氧气产生ROS,但是随着氧气的消耗使细胞溶液处于缺氧状态,限制了后续ROS的产生,所以NPs@IR780给药组的ROS产生量较低。 而Hb-NPs@IR780给药组在光照消耗氧气的同时,Hb能够释放氧气来继续支持IR780产生ROS,有效地提高了ROS的产生量,从而证明了在细胞水平Hb-NPs@IR780同样能够促进PDT效果。

图4 HepG2细胞摄取NPs@IR780和Hb-NPs@IR780黑暗条件下和光照后细胞ROS的产生情况CLSM图像Fig.4 CLSM images of ROS generation in HepG2 cancer cells incubated with NPs@IR780 and Hb-NPs@IR780 in dark or in the absence of irradiation at 808 nm(100 mW/cm2)

2.3.3 细胞毒性实验

通过对样品在溶液和细胞水平的ROS检测证明了Hb-NPs@IR780的ROS要高于NPs@IR780,而大量的ROS则会造成细胞的死亡。 所以,利用HepG2肿瘤细胞继续考察Hb-NPs@IR780和NPs@IR780在PDT时对细胞的杀伤能力。 如图5所示,黑暗条件下,Hb-NPs@IR780和NPs@IR780对细胞均无毒性,而在进行光照治疗后,两种药物对肿瘤细胞的毒性随着药物浓度的增加而提高,并且Hb-NPs@IR780对肿瘤的杀伤率明显高于NPs@IR780。 Hb-NPs@IR780和NPs@IR780对肿瘤细胞的半数致死浓度(IC50)分别为1.17和1.88 mg/L。 细胞毒性实验进一步证明,Hb-NPs@IR780由于Hb的供氧能力,有效地提高了PDT治疗效果,从而提高了对肿瘤的杀伤效果。

图5 HepG2细胞对NPs@IR780和Hb-NPs@IR780在黑暗和光照处理后37 ℃培养48 h后细胞存活率(A)和IC50值(B)Fig.5 In vitro antitumor activity(A) and IC50(B) of NPs@IR780 and Hb-NPs@IR780 against HepG2 for 48 h

3 结 论

利用蛋白质等电点这一天然属性,将血红蛋白(Hb)转变为疏水状态,利用最常见的两亲性嵌段共聚物实现了对Hb和疏水光敏剂药物IR780的共担载,并且得到的Hb-NPs@IR780拥有良好的粒径稳定性和较低的药物泄漏量。 通过体外的溶液和细胞实验证明,相比于单独的IR780药物,Hb-NPs@IR780能够通过Hb释放氧气,实现氧气治疗与光动力治疗(PDT)的联合治疗,从而提高光敏剂的活性氧产生量,促进PDT对肿瘤细胞的杀伤效果。 这种等电点法制备Hb-光敏剂复合载药体系,为以Hb为基础的氧气治疗-PDT联合治疗体系设计提供了新的研究思路。

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