引用本文
郑飞, 王微, 于珊珊, 戴雨霖, 刘尚, 文连奎, 越皓. 高效液相色谱-飞行时间质谱联用法分析人参及人参皂苷与山楂配伍过程中的水解行为[J]. 应用化学, 34(6): 723-728
ZHENG Fei, WANG Wei, YU Shanshan, et al. Hydrolysis Behaviors of Combined Dectotion of Panax ginseng and Ginsenosides with Hawthorn by HPLC-Q-TOF MS/MS [J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 34(6): 723-728  
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高效液相色谱-飞行时间质谱联用法分析人参及人参皂苷与山楂配伍过程中的水解行为
郑飞a,b, 王微a, 于珊珊a, 戴雨霖a, 刘尚a, 文连奎b,*, 越皓a,*
a长春中医药大学,吉林省人参科学研究院 长春 130117
b吉林农业大学食品科学与工程学院 长春 130118
通讯联系人:越皓,研究员; Tel/Fax:0431-86763986; E-mail:yuehao@sohu.com; 研究方向:中药化学和有机质谱学

共同通讯联系人:文连奎,教授; Tel/Fax:0431-84533104; E-mail:wenliankui@163.com; 研究方向:长白山野生资源开发

收稿日期:2016-09-20 修回日期:2016-11-18 接受日期:2016-12-28
基金:国家自然科学基金(3140040275)资助;
摘要

利用高效液相色谱-飞行时间质谱联用的方法,分别对人参配伍山楂前后人参皂苷的变化进行分析,同时对人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd与山楂配伍的水解规律进行系统研究,并与单独煎煮液、仿山楂配伍pH值煎煮液的水解产物进行比较,结果发现人参与山楂配伍后人参皂苷Rg1、Rb1含量明显减少,而人参皂苷Re、Rd、Rg2、Rg3、F2、Rh1含量明显增加,其中人参皂苷Re与山楂配伍后水解产物为人参皂苷20( R)-Rg2、20( S)-Rg2,仿山楂配伍pH值水解产物为人参皂苷20( R)-Rg2、20( S)-Rg2、Rg4、Rg6;人参皂苷Rg1与山楂配伍后水解产物为20( S)-Rh1、20( R)-Rh1,仿山楂pH值水解产物为20( S)-Rh1、20( R)-Rh1、Rh4、Rk3;人参皂苷Rb1与山楂配伍后水解产物为Rd、20( S)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为F2、20( S)-Rg3;人参皂苷Rd与山楂配伍后水解产物为F2、20( S)-Rg3、20( R)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为20( S)-Rg3、20( R)-Rg3。 研究表明,不同人参皂苷和山楂配伍后与仿山楂pH值的水解产物并不相同,人参与山楂配伍改变了人参皂苷成分的种类及含量。 本研究为临床方剂中人参与山楂配伍后成分的变化提供物质基础数据。

关键词: 高效液相色谱-飞行时间质谱; 人参皂苷; 配伍; 水解
中图分类号:O657.6 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2017)06-0723-06
Hydrolysis Behaviors of Combined Dectotion of Panax ginseng and Ginsenosides with Hawthorn by HPLC-Q-TOF MS/MS
ZHENG Feia,b, WANG Weia, YU Shanshana, DAI Yulina, LIU Shanga, Wen Liankuib, YUE Haoa
a Jilin Ginseng Academy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China
b College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China
Corresponding author:YUE Hao, professor; Tel/Fax:0431-86763986; E-mail:yuehao@sohu.com; Research interests:chemistry of traditional chinese medicine and organic mass spectrometry

Co-corresponding author:WEN Liankui, professor; Tel/Fax:0431-84533104; E-mail:wenliankui@163.com; Research interests:exploitation of wild resources of Changbai Mountain

Received:2016-09-20 Revised:2016-11-18 Accepted:2016-12-28
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.3140040275); }
Abstract

High performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry(HPLC-Q-TOF MS/MS) were used for the comparative analysis of the content of ginsenosides in the decoction of Panax ginseng with hawthorn and hydrolysis of ginsenosides in compatibility of ginsenosides Re, Rg1, Rb1, Rd with hawthorn, single decoction and simulated pH value decoction. The results show that the contents of ginsenosides Rg1 and Rb1 decrease, while the contents of ginsenosides Re, Rd, Rg2, Rg3, F2, Rh1 increase in ginseng-hawthorn combined decoction. Ginsenosides 20( R)-Rg2, 20( S)-Rg2 are the hydrolysates when ginsenoside Re and hawthorn are boiled together, while others are ginsenosides 20( R)-Rg2, 20( S)-Rg2, Rg4 and Rg6 when ginsenoside Re is boiled in the same pH value without hawthorn. In addition, the hydrolysates are ginsenosides 20( S)-Rh1 and 20( R)-Rh1 in ginsenoside Rg1-hawthorn combined decoction, but ginsenosides 20( S)-Rh1, 20( R)-Rh1, Rh4, Rk3 are determined in the simulated pH value decoction. Ginsenosides Rd, 20( S)-Rg3 are the major hydrolysates in co-decoction of ginsenoside Rb1 and hawthorn, while ginsenosides F2, 20( S)-Rg3 are the major hydrolysates from the simulated pH value decoction. Ginsenosides F2, 20( R)-Rg3, 20( S)-Rg3 are hydrolysates in ginsenoside Rd-hawthorn combined decoction, but ginsenosides 20( R)-Rg3, 20( S)-Rg3 are hydrolysates in the simulated pH value decoction. The hydrolysis of ginsenosides is different in the processes of co-decoction with hawthorn and the simulated pH value decoction, which may be the basis of chemical composition in combination of Panax ginseng and hawthorn. It provides the material bases for combination of Panax ginseng and hawthorn in prescriptions of traditional Chinese medicine.

Keyword: HPLC-Q-TOF MS/MS; ginsenoside; combination; hydrolysis

人参,五加科植物人参 Panax ginseng C.A. Mey.的干燥根,人参皂苷是人参中的主要活性成分,属三萜类化合物,根据其皂苷元的结构,可分为3种类型,人参二醇型如人参皂苷Rb1、Rb2、Rd、Rg3等,人参三醇型如人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rh2等和齐墩果烷型[1,2]。 在传统中医方剂中人参与山楂的配伍超过数百首,现代中医临床中常将人参与山楂配伍,起到补气健脾、行气化瘀、生津养心之功效,用于治疗脂肪肝引起的脾虚、气滞、癖血阻滞[3]、辅助降血脂[4]等,同时对心肌缺血-再灌注损伤具有多重保护作用[5]。 由于人参和山楂本身药效成分的差异,以及它们在共同煎煮过程中的相互影响,使得有效成分的结构发生改变。 本实验利用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF MS)及串联质谱(MS/MS)技术[6],对人参配伍山楂前后主要皂苷的变化规律进行研究,并对三醇型人参皂苷Re、Rg1和二醇型人参皂苷Rb1、Rd与山楂配伍的水解规律进行研究,与单独煎煮液、仿山楂配伍pH值煎煮液的水解产物进行比较,对水解产物进行分析鉴定。 本实验旨在为人参与山楂的配伍方面的化学物质基础提供新的思路与方法,并为人参和山楂在临床应用提供参考,开发其应用的新领域。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

Agilent 1200型高效液相色谱(HPLC,美国Agilent公司),Agilent 6520 Q-TOF型质谱仪(MS,美国Agilent公司)。 人参、山楂(均购于吉林省宏检医药药材有限公司);人参皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd对照品(均购于南京泽朗医药科技有限公司,纯度>98%);乙腈(色谱级,TEDIA公司),超纯水,其它试剂均为分析级。

1.2 实验方法

1.2.1 人参与山楂配伍样品的制备 取人参粗粉10 g,精密称定,加10倍量水于100 ℃煎煮2 h,冷却至室温,加适量无水乙醇使含醇量达70%,放置24 h,滤过,将溶液挥干,加水溶解于25 mL量瓶中,稀释并定容至刻度,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为人参单煎液。 另取人参粗粉10 g,山楂粗粉30 g,按上述方法制备,作为人参与山楂配伍共煎液。 各样品平行制备3份。

1.2.2 人参单体皂苷与山楂配伍样品的制备 分别准确称取5 mg人参皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd,加10倍量水于100 ℃煎煮2 h,冷却至室温,加适量无水乙醇使含醇量达70%,放置24 h,滤过,将溶液挥干,加水溶解于25 mL容量瓶中,稀释并定容至刻度,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为人参单体皂苷单煎液。 另分别准确称取5 mg人参皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd,加3倍量山楂粉末,按上述方法制备,得人参皂苷与山楂配伍共煎液。 再分别准确称取5 mg人参皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd,加10倍量的水(醋酸调节pH值至3),按上述方法制备,得仿山楂pH值煎煮液。 各样品平行制备3份。

1.2.3 色谱与质谱分析条件 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×150 mm,3.5 μm);梯度洗脱:流动相:(A)0.1%甲酸水溶液-(B)乙腈;流动相梯度:0~5 min,B 15%~17%;5~10 min,B 17%~19%;10~20 min,B 19%~21%;20~26 min,B 21%~28%;26~37 min,B 28%~30%;37~45 min,B 30%~36%;45~50 min,B 36%~45%;50~58 min,B 45%~65%;58~60 min,B 65%~80%;柱温35 ℃,流速0.3 mL/min,进样量5 μL。

采用电喷雾负离子扫描模式(ESI-);干燥器流速(N2)为9 L/min,干燥器温度300 ℃,雾化电压35 psi,毛细管电压为3.5 kV,碎裂电压175 V,锥孔电压65 V,质量扫描范围 m/z 100~2000。 实验数据采用Masshunter Qualitative Analysis软件分析处理。

2 结果与讨论
2.1 人参与山楂配伍前后人参皂苷成分变化规律的分析

利用HPLC-Q-TOF MS/MS法对人参与山楂配伍前后煎煮溶液中人参皂苷成分进行了比较分析,如图1所示为人参单煎液总离子流图及与山楂配伍后共煎液总离子流图。 通过HPLC可以较好的分离溶液中的皂苷类化合物,并由MS获得化合物相对分子质量和结构信息,人参皂苷在负离子模式一级质谱图中,准分子离子以[M-H]-和[M+HCOO]-形式存在,在相同条件下,通过与标准品的保留时间、一级质谱中相对分子质量信息以及二级串联质谱图中碎片离子信息,能够确定皂苷的类型及结构[7]。

图1 人参单煎液( A)和人参-山楂配伍合煎液( B)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of ginseng single decoction( A) and ginseng-hawthorn combined decoction( B)

以人参皂苷20( S)-Rg3为例(图2),说明鉴定人参皂苷的裂解规律。 人参皂苷20( S)-Rg3为二醇型人参皂苷,其C-3位取代是两分子的葡萄糖侧链,C-20位取代为H。 在负离子谱中,人参皂苷20( S)-Rg3主要以准分子离子[M+HCOO]-( m/z 829.4838)的形式存在,如图2 A所示。 在一定的碰撞能量下,[M+HCOO]-可以进一步碎裂,提供相应的结构碎片信息。图2 B给出了人参皂苷20( S)-Rg3多级串联质谱图, m/z 783丢失一个葡萄糖残基(162 amu)生成 m/z 621(Y1β),进一步丢失一个葡萄糖残基(162 amu)生成 m/z 459(Y0β), m/z 459离子是人参二醇皂苷元的特征离子。 图中 m/z 161为葡萄糖脱水形成的离子峰, m/z 221为葡萄糖与HCOO-形成的离子。 用同样的方法可以判定所测得的人参皂苷HPLC-MS/MS数据,以及发生含量变化的人参皂苷的平均相对含量,3个平行样品的峰面积相对标准偏差(RSD)值均小于2%,见表1。

图2 人参皂苷20( S)-Rg3一级( A)和二级( B)质谱图Fig.2 Mass spectrograms( A) and secondary mass spectrograms( B) of ginsenoside 20( S)-Rg3

表1 负离子模式下人参与山楂配伍前后煎煮液中人参皂苷的平均相对含量( n=3) Table 1 Average relative content of ginsenosides during combination of ginseng with hawthorn on negative ion mode( n=3)

实验结果表明,与人参单煎液相比较,人参与山楂配伍后溶液中人参皂苷Rg1、Rb1含量明显减少,人参皂苷Re、Rf、Rg2、Rc、Rb2、Rd等含量明显增加,人参皂苷20(glc)-Rf、noto-R1、mRg1、mRf、Rb3、mRb1、mRb2、mRb3、mRd等含量无明显变化,而人参皂苷20( S)-Rh1、20( R)-Rh1、Rg6、Rg4、Rk3、Rh4、F2、20( S)-Rg3、20( R)-Rg3、Rk1、Rg5为新生成的皂苷。

2.2 单体人参皂苷与山楂配伍前后水解产物的分析及比较

基于上述人参与山楂配伍前后人参皂苷的变化情况,为阐明皂苷类化合物的水解规律,本试验选取配伍前后皂苷含量变化明显的二醇型人参皂苷Rb1、Rd及三醇型人参皂苷Re、Rg1分别与山楂配伍,并与仿山楂配伍pH值煎煮液的水解产物进行比较分析,以人参皂苷Rg1为例,如图3所示为人参皂苷Rg1单煎液、与山楂配伍合煎液和仿山楂pH值煎煮液总离子流图,具体水解产物见表2。

图3 人参皂苷Rg1单煎液( A)、人参皂苷Rg1-山楂配伍合煎液( B)、人参皂苷Rg1仿pH值煎煮液( C)的总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of ginsenoside Rg1 single decoction( A), ginsenoside Rg1-hawthorn combined decoction( B) and ginsenoside Rg1 simulated pHvalue decoction( C)

表2 人参皂苷、与山楂配伍及仿pH值溶液的水解产物 Table 2 Hydrolysates of ginsenosides, compatibility with hawthorn and simulated pH value decoction

由表2可知,二醇型人参皂苷水解规律不完全相同,人参皂苷Rb1单煎液中水解产物为Rd、F2、20( S)-Rg3,与山楂配伍液中水解产物为Rd、20( S)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为F2、20( S)-Rg3;人参皂苷Rd单煎液中没有发生水解反应,与山楂配伍液中水解产物为F2、20( S)-Rg3、20( R)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为20( S)-Rg3、20( R)-Rg3。而三醇型人参皂苷水解规律相似,人参皂苷Re和Rg1单煎液中均未发生水解反应,与山楂配伍液中人参皂苷Re的水解产物为20( R)-Rg2、20( S)-Rg2,人参皂苷Rg1水解产物为20( S)-Rh1、20( R)-Rh1,仿山楂pH值液中人参皂苷Re的水解产物为20( R)-Rg2、20( S)-Rg2、Rg4、Rg6,人参皂苷Rg1水解产物为20( S)-Rh1、20( R)-Rh1、Rh4、Rk3。

3 结论

二醇型人参皂苷在反应中存在以下水解途径:人参皂苷Rb1C-20位的末端Glc取代基优先被水解,C-3位的保持不变,生成人参皂苷Rd,C-20Glc取代基进一步丢失后的水解产物20( S)-Rg3;人参皂苷Rb1 C-3末端Glc丢失后,进一步丢失C-20位末端Glc的水解产物F2;人参皂苷Rb1 C-20末端Glc-Glc丢失后水解产物20( S)-Rg3。 三醇型人参皂苷在反应中存在以下水解途径:人参皂苷Re C-20位末端Glc优先丢失后生成20( S)-Rg2和20( R)-Rg2,然后20(21)位和20(22)位脱水后形成产物Rg4/Rg6;人参皂苷Rg1 C-20末端Glc丢失后的产物20( S)-Rh1和20( R)-Rh1,进而20(21)位和20(22)位脱水后形成产物Rh4/Rk3。

山楂中主要含有黄酮类、黄烷及其聚合物类、有机酸类,另外还有三萜类和甾体类等成分[8]。 在与人参配伍过程中使不同人参皂苷之间发生转化,形成新的水解产物,通过水解产物的鉴定,推断了人参皂苷Re、Rg1、Rb1和Rd的化学转化方式,包括水解和脱水反应。 从化学成分变化的角度初步揭示了人参与山楂药对配伍的科学内涵,配伍过程中不仅改变了体系中的pH值,同时体系中许多成分之间可能发生相互作用,进而使复方化学成分的含量及种类发生变化。 本工作探索了人参皂苷与山楂配伍后的水解规律,为临床方剂中人参与山楂配伍的合理利用和开发提供了科学依据。

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