引用本文
吴业红, 赵霞, 胡君, 林园, 王倩. 球状功能性烟草花叶病毒纳米颗粒的制备及表征[J]. 应用化学, 34(4): 379-384
WU Yehong, ZHAO Xia, HU Jun, et al. Preparation and Characterization of Functional Tobacco Mosaic Virus Spherical Nanoparticles[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 34(4): 379-384  
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球状功能性烟草花叶病毒纳米颗粒的制备及表征
吴业红a,b, 赵霞a, 胡君a, 林园a,*, 王倩a,c
a中国科学院长春应用化学研究所,高分子物理与化学国家重点实验室 长春 130022
b中国科学院大学 北京 100049
c美国南卡罗莱纳大学化学与生物化学系 美国 南卡罗莱纳州 29208
通讯联系人:林园,副研究员; Tel:0431-85262658; Fax:0431-85262126; E-mail:linyuan@ciac.ac.cn; 研究方向:功能型生物纳米材料
收稿日期:2016-07-28 修回日期:2016-08-31 接受日期:2016-10-08
基金:国家自然科学基金(21374119,21429401)、长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室基金以及天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室开放基金资助;
摘要

烟草花叶病毒(TMV)由于其良好的生物相容性、单分散性、多价性、低成本等优点,已作为功能材料的基本构筑单元应用于光电器件、组织工程、疫苗载体,无机纳米材料制备等研究领域。 然而,相比于棒状的TMV,球状TMV纳米颗粒无核酸分子,抗环境影响能力更强,比表面积更大。 本文利用蛋白质的热致变性原理,对经基因和化学改性后的棒状TMV如半胱氨酸突变体(TMV-Cys)、赖氨酸突变体(TMV-EPMK)和 β-环糊精( β-CD)修饰的TMV(TMV- β-CD)进行热变性处理,探究其形成球型纳米颗粒(TMV-SNP)的能力及功能性。 结果显示,改性后的TMV经历热变性后可得到形貌均一的球型纳米颗粒,且其暴露在纳米颗粒表面的功能基团Cys、Lys和 β-CD仍具有反应活性。

关键词: 烟草花叶病毒; 热变性; 球型纳米颗粒; 功能性; 突变体
中图分类号:O636 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2017)04-0379-06
Preparation and Characterization of Functional Tobacco Mosaic Virus Spherical Nanoparticles
WU Yehonga,b, ZHAO Xiaa, HU Juna, LIN Yuana, WANG Qiana,c
aChangchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130022,China
bUniversity of Chinese Academy of Sciences,Beijing 10049,China
cUniversity of South Carolina,South Carolina 29208,USA
Corresponding author:LIN Yuan, associate professor; Tel:0431-85262658; Fax:0431-85262126; E-mail:linyuan@ciac.ac.cn; Research interests:functional bionanomaterials
Received:2016-07-28 Revised:2016-08-31 Accepted:2016-10-08
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21429401, No.21374119), the State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry and the State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments, Tianjin University;
Abstract

Tobacco mosaic virus(TMV) due to its good biocompatibility, monodisperse, multivalent, low cost and other advantages, has been used as the basic building blocks used in optoelectronic devices, tissue engineering, vaccine vector, inorganic material preparation fields. However, compared to the rod like TMV, spherical TMV nanoparticles with no nucleic acid molecules are more resistant to environmental impact and have a larger specific surface area. The genetic and chemical modification of TMV, such as cysteine mutants of TMV(TMV TMV-Cys), lysine mutant of TMV(TMV-EPMK) and β-cyclodextrin( β-CD) modified TMV(TMV- β-CD) were conducted by thermal denaturation, and we studied their formation process and functionality. The results shows that the modified TMV can transit into the uniform spherical nanoparticles, and the functional groups exposed to the surface of the nanoparticles still keep their reactive ability.

Keyword: tobacco mosaic viruses; thermal denaturation; spherical nanoparticles; functionality; mutant

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)长300 nm,外径18 nm,内径4 nm,整个病毒是由2130个外壳蛋白亚单元围绕单链RNA螺旋排列而成的中空管状结构。 TMV由于具有良好的生物相容性、单分散性、多价性、低成本等优点,已作为功能材料的基本构筑单元应用于光电器件[1]、组织工程[2,3]、疫苗载体[4,5]和无机纳米材料制备[6]等研究领域。 例如,Niu等[7 ]以TMV作为生物模板,利用化学氧化的方法在其表面包裹了聚苯胺,从而得到导电纳米线。 同时,利用TMV的表面拓扑形貌以及化学性质,将TMV沉积到基底上可用于促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[8]。 此外,由于TMV具有多价的蛋白质外壳及其表面含有丰富的功能基团,因此可利用基因工程和化学修饰的方法将功能化组分修饰在颗粒表面,从而构建功能型材料。 我们课题组[9]前期通过化学改性的方法,首先将 β-环糊精( β-cyclodextrin, β-CD)连接在TMV上,同时将荧光素、叶酸及紫杉醇等修饰在金刚烷上,然后利用 β-环糊精与金刚烷间形成的超分子相互作用,构建了以TMV作为载体的具有靶向、治疗和成像的多功能性纳米材料。 与此同时,通过基因工程技术可在TMV外壳蛋白表面引入半胱氨酸残基、赖氨酸残基,其中半胱氨酸残基提供的巯基基团可增强TMV与金属纳米粒子结合能力[10,11],而赖氨酸残基提供的氨基基团提高了TMV作为药物载体或影像试剂的负载率和特异性[12,13]。

最近,Atabekov等[14]将野生型TMV通过热致变性的方法将棒状TMV转变为球型纳米颗粒(TMV spherical nanoparticle,TMV-SNP)。 球状TMV纳米颗粒无核酸分子,抗环境影响能力强,比表面积大,与天然TMV相比,可吸附更多的抗原、多肽,刺激小鼠产生更强的免疫反应[15,16]。 如前所述,可利用基因工程和化学修饰的方法将功能化组分修饰在TMV表面,经修饰后的TMV是否仍遵从热致变性规律以及经高温处理后其功能化基团是否保持反应活性是本文的主要研究内容。 因此,本文将针对经基因改性的半胱氨酸突变体TMV(TMV-Cys)、赖氨酸突变体TMV(TMV-EPMK)和经化学改性的 β-环糊精修饰的TMV(TMV- β-CD)进行热变性,探究其经历热变性之后的形貌及功能性。 这些功能性的球型TMV纳米颗粒可为进一步丰富该新型蛋白纳米颗粒的种类及拓展TMV球型纳米颗粒的应用范围做出贡献。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器

异硫氰酸荧光素(FITC)购自Sigma公司,Modified Lowry Protein Assay Kit购自Thermo Scientific公司,所用试剂均为分析纯。

Milli-Q system型超纯水制备仪(德国Merk Millipore公司),Nano Drop 2000c型紫外可见分光光度计(UV-Vis,美国Thermo Scientific公司),H-8000型透射电子显微镜(TEM,日本Hitachi公司),Optima L-80 XP型超速离心机(美国Beckman公司),LSM700型激光共聚焦显微镜(CLSM,德国Zeiss公司),动态粒径分析仪(DLS,英国Malvern公司),AKTA explorer型快速蛋白液相色谱(FPLC,美国GE公司),GeneAmp 9700型聚合酶链式反应仪(PCR,美国ABI公司)。

1.2 球型功能性TMV纳米颗粒的制备及鉴定

1.2.1 基因修饰TMV球型纳米颗粒制备 在本研究中我们选择了两种突变体TMV,分别为Cys突变体TMV(TMV-Cys)和Lys突变体TMV(TMV-EPMK)。 TMV-Cys提供活性巯基反应位点,该突变体在TMV外壳蛋白的N-端的Ser2和Tyr3之间插入Cys[17]。 TMV-EPMK提供活性氨基反应位点,该突变体在TMV外壳蛋白N-端的Met 1和Ser 2之间插入含有Lys的短肽[12]。 参照文献[18]中报道的方法提取突变体TMV及TMV。 将TMV、TMV-Cys和TMV-EPMK溶液用超纯水分别稀释至1 g/L,吸取100 μL加入PCR管中。 用PCR仪96 ℃ 加热2 min。 溶液经5000 g离心20 min,去上清,沉淀用超纯水复溶。 Modified Lowry Protein Assay Kit测定蛋白浓度。 应用TEM和DLS分析球型纳米颗粒形貌、粒径和表面电势。

1.2.2 化学修饰TMV球型纳米颗粒制备 TMV- β-CD为本研究组结合TMV的Tyr139位点发生的重氮偶联和铜催化的叠氮-炔基环加成反应(Copper-catalyzed azide alkyne cycloaddition,CuAAC)将 β-CD修饰在TMV表面。 在金刚烷胺上修饰荧光素罗丹明B(Ada-RhB)、靶向配体叶酸及抗癌药物紫杉醇,利用 β-CD与金刚烷分子发生结合的超分子化学修饰方法,可将多种功能小分子同时结合在TMV表面上。 TMV- β-CD和Ada-RhB参考文献[9]制备。 TMV- β-CD用超纯水稀释至0.5 g/L,采用1.2.1节中的方法制备及表征球型纳米颗粒。

1.3 TMV-Cys-SNP和TMV-EPMK-SNP的功能性分析

1.3.1 TMV-Cys-SNP 用0.01 mol/L pH=7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS) 稀释TMV-Cys-SNP至1 g/L。 加入200 μL含金纳米粒子的柠檬酸钠水溶液。 室温搅拌20 min,5000 g离心20 min,去上清,沉淀用0.01 mol/L pH=7.4 PBS复溶。 应用TEM观察TMV-Cys-SNP与金纳米颗粒的结合情况,同时以TMV-SNP作为对照。

1.3.2 TMV-EPMK-SNP 用0.1 mol/L pH=9.0的碳酸盐缓冲液稀释TMV-EPMK-SNP至1 g/L,将FITC按照 m(TMV-EPMK-SNP): m(FITC)=10:1缓慢加入反应液中。 室温避光反应过夜,将反应物经5000 g离心20 min,去上清,沉淀用0.01 mol/L pH=7.4 PBS润洗3次。 然后置入截留相对分子质量为3.5×103的超滤管中,10000 g离心30 min,反复离心5次,去除未结合的FITC。 应用CLSM和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定TMV-EPMK-SNP与FITC的结合情况。

1.4 TMV- β-CD-SNP功能性分析

用0.01 mol/L pH=7.4 PBS将TMV- β-CD-SNP稀释至1 g/L,加入100 μL 1 g/L的Ada-RhB。 4 ℃温和搅拌过夜,将反应物经5000 g离心20 min,去上清,沉淀用0.01 mol/L pH=7.4 PBS润洗3次。 然后置入截留相对分子质量为3.5×103的超滤管中,10000 g离心30 min,反复离心5次,去除未结合的小分子。 经0.45 μm滤膜过滤,应用FPLC分析TMV- β-CD-SNP与Ada-RhB的结合情况。

2 结果与讨论
2.1 功能性TMV-SNP的表征

TEM结果显示,经基因改性后的TMV-Cys(图1 A)和TMV-EPMK(图1 C)保持如野生型TMV完整的管状结构。 经热变性后,二者均由管状转变为形貌、尺寸均一的球型纳米颗粒(图1 B,1 D)。 DLS结果显示,TMV-Cys-SNP和TMV-EPMK-SNP的平均粒径分别为152和200 nm(图1 E)。 多分散指数(PDI)分别为0.038和0.062,表明纳米颗粒的单分散性较好。 据文献[14]报道,野生型TMV在热变性形成球型纳米颗粒的过程中,经历两个结构变化过程:首先在90 ℃,野生型TMV一端或两端发生膨胀,形成了无规则的颗粒,随后当加热至94 ℃时,这些无规则颗粒形成了形貌均一的球型颗粒。 经测算,单个野生型TMV经热变性之后形成的TMV-SNP的直径约为53 nm。 对于形成粒径较大的TMV-SNP原因可能是高浓度下TMV在热变性过程中,TMV头-尾或侧向发生聚集,进而形成了较大的纳米颗粒。 TMV-Cys和TMV-EPMK在超纯水中的表面电势分别为(-32.1±0.3) mV和(-20.1±0.5) mV,经热变性后所对应的球型纳米颗粒的表面电势分别为(-31.0±0.8) mV和(-22.6±1.1) mV(图1 F)。 虽然TMV的外壳蛋白经热变性之后其二级结构发生明显变化,由 α螺旋占多数转变为 β折叠为主导[19],但纳米颗粒的表面电势未发生明显变化。

图1 TMV-Cys( A)、TMV-Cys-SNP( B)、TMV-EPMK( C)和TMV-EPMK-SNP( D)的TEM照片; TMV-Cys-SNP和TMV-EPMK-SNP粒径分析( E);TMV-Cys、TMV-Cys-SNP、TMV-EPMK和TMV-EPMK-SNP的表面电势( F)Fig.1 TEM images of TMV-Cys( A), TMV-Cys-SNP( B), TMV-EPMK( C) and TMV-EPMK-SNP( D); DLS results of TMV-Cys-SNP and TMV-EPMK-SNP( E); Zeta potentials of TMV-Cys, TMV-Cys-SNP,TMV-EPMK and TMV-EPMK-SNP( F)

2.2 TMV-Cys-SNP-Au和TMV-EPMK-SNP-FITC的表征

将TMV-Cys-SNP与Au共孵育后所得到的溶液呈现紫色,TEM结果显示Au纳米颗粒均匀吸附在TMV-Cys-SNP表面(图2 A),而对照组将TMV-SNP与Au共孵育后所得到的溶液未见明显紫色,TEM结果显示仅见少部分Au纳米颗粒吸附在TMV-SNP表面上,且分布不均匀(图2 B)。 该结果说明TMV-Cys-SNP通过半胱氨酸的巯基与Au纳米颗粒形成了金属键,进而增强了Au纳米颗粒吸附程度。 CLSM可见TMV-EPMK-SNP经FITC标记后,其形貌仍为球型,且呈现较强的绿色荧光(图2 C)。 我们进一步应用SDS-PAGE表征,结果显示,修饰后的TMV-EPMK-SNP-FITC与相应的未修饰的TMV-EPMK-SNP相比,泳动速度变慢,病毒纳米颗粒蛋白单体相对分子质量的增加证明了FITC成功修饰在TMV-EPMK-SNP表面。 经紫外光照射下,修饰后的TMV-EPMK-SNP-FITC的单体和二聚体均可见明显的绿色荧光(图2 D),由此也进一步证明了FITC成功修饰在TMV-EPMK-SNP的表面。

图2 TMV-Cys-SNP( A)和TMV-SNP( B)与Au纳米颗粒混合后的TEM照片,相应插图分别为其混合溶液;TMV-EPMK-SNP-FTIC经干燥后沉积在基底上的CLSM图像( C);TMV-EPMK-SNP-FTIC的SDS-PAGE结果( D): (1)TMV-EPMK-SNP, (2)TMV-EPMK-SNP-FITCFig.2 TEM images of TMV-Cys-SNP( A) and TMV-SNP( B) mixed with Au nanopaticles, the related inset shows the photograph of the mixed solution; CLSM image of TMV-EPMK-SNP-FITC after drying( C); SDS-PAGE analysis of TMV-EPMK-SNP-FITC under white light after Coomassie Blue(CB) staining(to detect the protein)(left) and under UV light (to detect the FITC label)(right)( D):(1)TMV-EPMK-SNP, (2)TMV-EPMK-SNP-FITC

2.3 TMV- β-CD-SNP-Ada-RhB的表征

TEM结果显示,TMV- β-CD在热变性条件下可形成均一的球型纳米颗粒(图3 A),DLS结果显示其平均粒径为88 nm(图3 B)。 为了进一步探究TMV- β-CD经热变性形成球型纳米颗粒后是否仍能与Ada-RhB发生主体-客体( β-CD/Ada)相互作用。 我们将TMV- β-CD-SNP与Ada-RhB共孵育。 FPLC结果显示,TMV- β-CD-SNP-Ada-RhB在568 nm波长处的吸收强度明显增强(图3 C),这是由Ada-RhB的特征吸收引起。 而对照组在568 nm波长处的吸收强度未见明显增强,表明未修饰的TMV-SNP与Ada-RhB没有明显的特异性相互作用(图3 D)。 该结果表明,TMV- β-CD经热变性后,暴露在纳米颗粒表面的 β-CD仍具有与Ada-RhB结合的能力。

图3 TMV- β-CD-SNP的TEM图像( A)和粒径分布结果( B);TMV- β-CD-SNP-Ada-RhB( C)和TMV-SNP-Ada-RhB( D)的FPLC图谱Fig.3 TEM image( A) and DLS result( B) of TMV- β-CD-SNP, size-exclusion chromatography(SEC) diagrams of TMV- β-CD-SNP-Ada-RhB( C) and TMV-SNP-Ada-RhB( D)

3 结 论

经过基因和化学改性后的烟草花叶病毒(TMV)纳米颗粒如半胱氨酸突变体TMV(TMV-Cys)、赖氨酸突变体TMV(TMV-EPMK)和 β-环糊精修饰的TMV(TMV- β-CD)与野生型TMV相同,在经历热变性过程后仍可转变为形貌均一的球型纳米颗粒,其形成球型纳米颗粒的过程不受TMV外壳蛋白上单个氨基酸修饰或突变的影响,且其暴露在纳米颗粒外表面的功能基团Cys、NH2和 β-CD仍具有反应活性。 因此,这种源于同一种病毒的(即相同的蛋白组成成分)不同形状的纳米颗粒为进一步深入探究纳米材料结构与功能的关系提供了一种独特、新型的研究工具。

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