引用本文
周佳, 倪赟, 张承武, 仇兴汉, 赵燕菲, 白磊, 张高宾, 李林. 嘧啶基双光子荧光染料的设计合成与生物成像[J]. 应用化学, 34(12): 1450-1456
Jia ZHOU, Yun NI, Chengwu ZHANG, et al. Design and Synthesis of Pyrimidine Based Two-Photon Fluorescence Probe and Its Application in Bioimaging[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 34(12): 1450-1456  
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嘧啶基双光子荧光染料的设计合成与生物成像
周佳, 倪赟, 张承武*, 仇兴汉, 赵燕菲, 白磊, 张高宾*, 李林*
南京工业大学,柔性电子重点实验室&先进材料研究院,江苏先进生物与化学制造协同创新中心 南京210009
通讯联系人:李林,教授; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamlli@njtech.edu.cn; 研究方向:生物探针

共同通讯联系人:张承武,研究员; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamcwzhang@njtech.edu.cn; 研究方向:生物探针

共同通讯联系人:张高宾,博士后; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamgbzhang@njtech.edu.cn; 研究方向:荧光染料

收稿日期:2017-09-05 修回日期:2017-10-23 接受日期:2017-10-23
基金:国家自然科学基金(81672508,61505076)和江苏省高校自然科学研究重大项目(16KJA180004)资助;
摘要

生理条件下光学性质稳定的双光子荧光染料在生物成像领域具有广阔的应用前景。 我们使用2,4-二甲基-6-羟基嘧啶与4-( N, N-二甲氨基)苯甲醛进行缩合反应,设计合成了具有双光子荧光性质的化合物2-[(1 E)-2-[4-(二甲氨基)苯基]乙烯基]-6-甲基-4(3 H)-嘧啶(NHP)。 通过质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)、紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱等技术手段表征了其结构,研究了其光物理性质,以及外部环境改变对其发射光谱的影响。 结果表明,化合物NHP的最佳吸收峰位于400 nm,最佳发射峰位于540 nm左右,且荧光发射不受金属离子、氨基酸和pH等环境因素的影响。 生物实验结果表明,化合物NHP细胞毒性较小,且具有很好的活细胞和果蝇脑组织成像效果,是一种较为理想的双光子荧光生物成像染料。

关键词: 嘧啶衍生物; 双光子成像; 荧光探针; 生物成像
中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1000-0518(2017)12-1450-07
Design and Synthesis of Pyrimidine Based Two-Photon Fluorescence Probe and Its Application in Bioimaging
Jia ZHOU, Yun NI, Chengwu ZHANG, Xinghan QIU, Yanfei ZHAO, Lei BAI, Gaobin ZHANG, Lin LI
Key Laboratory of Flexible Electronics(KLOFE) & Institute of Advanced Materials(IAM),Jiangsu National Synergetic Innovation Center for Advanced Materials(SICAM),Nanjing Tech University(Nanjing Tech),Nanjing 211816,China
Corresponding author:LI Lin, professor; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamlli@njtech.edu.cn; Research interests:biological probes

Co-corresponding author:ZHANG Chengwu, professor; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamcwzhang@njtech.edu.cn; Research interests:biological probes

Co-corresponding author:ZHANG Gaobin, postdoctoral; Tel/Fax:025-83587982; E-mail:iamgbzhang@njtech.edu.cn; Research interests:fluorescence dyes

Received:2017-09-05 Revised:2017-10-23 Accepted:2017-10-23
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672508, No.61505076), the Major Projects of Natural Science Research in Colleges and Universities in Jiangsu(No.16KJA180004)
Abstract

In the field of biological imaging, two-photon fluorescent dyes with stable optical properties under physiological conditions have broad application prospects. Herein, we designed and synthesized a two-photon fluorescent dye 2-[(1 E)-2-[4-(dimethylamino)phenyl]ethenyl]-6-methyl-4(3 H)-pyrimidinone(NHP). NHP was obtained by condensation between 2,4-dismethyl-6-pyrimidinol and 4-dimethylaminobenzaldehyde. The chemical structure and optical properties of NHP was characterized by mass spectrometry(MS), nuclear magnetic resonance spectroscopy(NMR), ultraviolet-visible(UV-Vis) absorption spectra and fluorescence emission spectra method as well as the external environment change effect on the emission spectrum. The results show that the absorption peak of NHP is around 400 nm, and the emission peak of which is around 550 nm. The fluorescence emission of NHP is stable in various pH, ions and amino acids conditions. Furthermore, biological experimental results show that NHP is able to image HepG2/SH-SY5Y cells and Drosophila brains with negligible cytotoxicity. All of those indicate that NHP is an ideal two-photon fluorescence dye for bioimaging.

Keyword: pyrimidine derivatives; two-photon imaging; fluorescent probes; bioimaging

荧光成像是生物学研究的重要手段之一,开发具有优良成像效果的荧光染料一直是科学家们研究的热点。 随着荧光染料合成和成像技术的不断进步,传统的单光子荧光材料因其无法回避的缺点已经不能满足人们对高品质荧光生物成像的要求。 例如:短波长激发光会对细胞造成损伤,较短的激发波长限制了其穿透深度,激发光容易被细胞或组织吸收,较高的激发光能量加快了染料的光漂白等[1,2,3,4,5,6]。 而以近红外作为激发光的双光子荧光染料,能够同时吸收两个光子从基态跃迁到激发态,最后以辐射跃迁的方式回到基态,发出荧光,呈现长波激发、短波发射的特点。 与单光子荧光染料相比,双光子荧光染料在生物成像领域具有明显的优势,包括较大的组织穿透深度,较好的空间分辨率和更长的观测时间[7,8,9,10,11,12,13,14,15]。 因此,开发适合双光子生物成像的荧光染料具有重要的科学和现实意义。

嘧啶具有较强的电子亲和力和良好的分子平面性,是优异的双光子荧光活性基团,在双光子荧光设计合成中应用广泛。 同时,嘧啶类化合物生物相容性好,细胞毒小,在生物应用领域有独特的优势[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。 然而,由于嘧啶环上N原子能与金属离子和H+结合,导致大多数的含嘧啶基荧光染料易于受金属离子、氨基酸和pH等干扰,因此其在复杂的生理环境下不能保持稳定的荧光发射,不利于较长时间的成像观测。 到目前为止,如何获得在复杂生理环境中保持稳定荧光发射的含嘧啶基荧光染料,仍有待研究[28,29,30,31]。 果蝇的大脑具有复杂的神经系统和组织,且阻止药物到达中枢神经系统的屏障很弱,药物容易透过血脑屏障进入大脑,有利于筛选新的具有治疗作用的药物。 另外,果蝇具有易饲养、繁殖快、生长周期短、后代多的特点,且携带了大量与人类的神经功能相关基因相同的基因,实现果蝇3D成像在生物医学领域具有重要意义。

本文通过简单途径合成了一种嘧啶基双光子荧光染料2-[(1 E)-2-[4-(二甲氨基)苯基]乙烯基]-6-甲基-4(3 H)-嘧啶(NHP),测试了金属离子、氨基酸和pH等外部因素对其发光性质的影响,并将其应用于细胞和果蝇脑组织共聚焦荧光成像中。 化合物NHP的结构与合成路线如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthetic route of NHP

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

INOVA-300MHz型核磁共振仪(NMR,美国Varian公司);Waters Acquity型液相质谱联用仪(LC-MS,美国 Waters公司);BioTek Epoch型酶标仪(美国BioTek公司);LSM880型共聚焦显微镜系统(德国Zeiss公司)。

肝癌细胞株(HepG2)、人骨髓神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)和果蝇来源于南京工业大学生物电子研究所,乙酰乙酸乙酯,盐酸乙脒,4-( N, N-二甲基)苯甲醛均为分析纯试剂,来自上海Adamas-beta公司,其余试剂均为国产市售分析纯。

1.2 化合物NHP的合成

参考文献[32]合成2,4-二甲基-6-羟基嘧啶。 产物为白色固体,产率80%;mp 140~142 ℃;1H NMR(CDCl3,300 MHz), δ:2.34(s,3H),2.42(s,3H),6.13(s,1H),9.19(s,1H)。

将2,4-二甲基-6-羟基嘧啶(1.25 g,10 mmol)、4-( N, N-二甲基)苯甲醛(1.50 g,15 mmol)和20 mL乙醇加入到圆底烧瓶中,混合均匀后,再加入10 mL HCl(1 mol/L),90 ℃,反应48 h。 待反应结束后,向混合液加入100 mL水中,碳酸氢钠中和pH值,二氯甲烷(DCM)萃取,无水硫酸钠干燥有机相,真空条件下旋干溶剂,经柱层析(洗脱剂: V(DCM): V(乙酸乙酯)=20:1)分离,得到黄色固体化合物NHP,产率60%。 mp 375~475 ℃;1H NMR(CDCl3,300 MHz), δ:2.34(s,3H),3.30(s,6H),6.15(s,1H),6.62(d, J=9 Hz,1H),6.69(d, J=6 Hz,2H),7.51(d, J=6 Hz,2H),7.90(d, J=9 Hz,1H);13C NMR(CDCl3,75 MHz), δ:23.91,40.11,108.86,112.05,114.0,123.10,129.56,140.60,151.62,156.13,165.23,166.88;MS(ESI-MS): m/z=255.14,计算值(C15H18N3O)+=256.10([M+H]+)。

1.3 待测溶液的配制

准确称取适量的化合物NHP,将其溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶液中配制成50 mmol/L的储备液。 用 V(甲醇): V(水)=1:1混合溶剂和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲液分别将储备液稀释为浓度为10 μmol/L的溶液,进行紫外光谱和荧光光谱的测试。 pH值4~11的溶液使用Hepes溶液配制,浓度为10 μmol/L。

1.4 细胞培养与果蝇饲养

HepG2和SH-SY5Y细胞分别培养于含有10%胎牛血清(FBS)、100.0 mg/L链霉素和100 IU/mL青霉素的Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中,细胞密度长至70%~80%时用于细胞毒性及荧光成像实验。

野生型果蝇(Drosophilamelanogaster)喂养于配制的培养基中(水800 mL、玉米粉84 g、白砂糖60 g、琼脂6 g、丙酸5 mL、酵母粉16 g),果蝇养至20 d,用细镊子在磷酸盐缓冲液(PBS)中分离果蝇脑组织用于荧光成像实验。

2 结果与讨论
2.1 化合物NHP的光物理性质研究

首先,研究了化合物NHP在 V(甲醇): V(水)=1:1的溶液和Hepes溶液中的紫外吸收和荧光发射光谱。 如图1所示,化合物NHP在两种溶剂中均只有一个吸收峰,在400 nm左右,两种溶剂中吸收峰位无明显差异(图1 A)。 化合物NHP也只有一个荧光发射峰,在极性较小的甲醇/水溶液中的发射峰位于530 nm,在极性较大的Hepes溶液中的发射峰位于548 nm。 随着溶剂极性的增加,化合物的荧光发射红移18 nm(图1 B)。 表明化合物NHP具有分子内电荷转移性质,这有利于分子 π电子的离域,增强化合物的发光强度。 进一步使用荧光素0.1 mol/L的NaOH溶液( Φ=0.85)作为参比,得到化合物NHP在Hepes溶液中的荧光量子产率为0.23。 使用Flu1为参比,得到化合物NHP的双光子吸收截面为270.3 GM[33]。 以上结果表明,化合物NHP具有良好的双光子荧光性质。

图1 NHP在不同溶剂中的吸收( A)和发射光谱( B)Fig.1 The absorption( A) and emission( B) spectra of NHP in different solvents

图2 NHP在不同溶液中的发射光谱。 ( A)NHP在不同pH值环境中的发射光谱;( B)手提式紫外灯照射下不同pH值环境中NHP溶液的荧光照片;( C)NHP在各种离子和氨基酸中的发射光谱;( D)手提式紫外灯照射下混合各种离子和氨基酸的NHP溶液荧光照片Fig.2 The emission spectra of NHP in different solutions. ( A)The emission spectra of NHP at different pH values; ( B)The picture of the fluorescence emission of NHP at different pH values; ( C)The emission spectra of NHP with different ions and amino acids; ( D)The picture of the fluorescence emission of NHP with different irons and amino acids as listed in ( C)

2.2 不同pH值、金属离子及氨基酸对化合物NHP响应性质的影响

生物体内环境的pH值为5~8,并且存在多种离子和氨基酸,内部环境可能会对染料的发光性质具有较大的影响。 为了验证化合物NHP在各种生理条件下的光学性质,配制了pH值为4~11的Hepes缓冲溶液、45种离子及氨基酸的溶液,检测了化合物对pH值、离子和氨基酸的响应。 如图2 A和2 B所示,以400 nm为激发波长,在pH值5~8的范围内,化合物NHP在荧光光谱变化不大,表明在生理环境中,化合物的荧光发射不受pH值的影响。 当pH值小于5时,由于N原子的质子化,ICT性质增强,导致荧光增强。 而当pH值大于8时,羟基发生去质子化,嘧啶基团吸电子能力减弱,ICT性质减弱,使荧光光谱发生蓝移(图2 A和2 B)。

为了进一步检测离子或者氨基酸对化合物NHP发光性质的影响,我们配置了45种常见离子和氨基酸的溶液,通过荧光光谱研究了化合物NHP对不同离子和氨基酸的响应。 如图2 C和图2 D所示,在化合物NHP的Hepes溶液中,分别加入10倍化学计量不同离子和氨基酸,化合物的荧光光谱并无明显的变化,表明常见离子及氨基酸不会影响其发光性质。 以上实验结果表明,化合物NHP具有稳定的荧光发射性质,在复杂的生理条件下,不受离子、氨基酸和pH值的影响。

2.3 化合物NHP的细胞及组织成像

低细胞毒性是荧光染料可以用于生物成像的必备条件。 因此,在生物成像实验前我们利用二甲氧唑黄(XTT)比色法对化合物NHP进行了细胞毒性测试。 实验中,我们将HepG2和SH-SY5Y细胞分别接种在2个96孔板中。 当细胞密度达到50%~60%时,在培养基中分别加入含有不同浓度的化合物NHP(0~100 μmol/L),继续培养12 h后,用PBS缓冲液洗涤3次,然后利用XTT比色法测定HepG2和SH-SY5Y的存活率。 结果表明,在0~100 μmol/L浓度范围内,化合物NHP对HepG2和SH-SY5Y细胞的存活率基本无影响,细胞存活率在95%以上(图3 A和3 B)。 说明化合物NHP具有较低的生物毒性,可以应用于细胞或者组织成像。

图3 NHP细胞毒性及细胞成像。 ( A)和( B)NHP在肝癌细胞和人骨髓神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性。 ( C)和( D)NHP在肝癌细胞和人骨髓神经母细胞瘤细胞中的细胞成像。 (1)和(5)为两种细胞成像的DIC图;(2)和(6)为两种细胞与NHP(5 μmol/L)和DMSO共孵育2 h的单光子荧光成像图;(3)和(7)为两种细胞分别与NHP(5 μmol/L)和DMSO共孵育2 h的双光子荧光成像图;(4)和(8)分别为(1)/(3)和(5)/(7)的重叠图。标尺为15 μmFig.3 Cytotoxicity of NHP and its applications in cell imaging. ( A) and ( B):Cytotoxicity of NHP(1~100 μmol/L) on HepG2 and SH-SY5Y, respectively, tested via XTT assay. ( C) and ( D):One- and two-photon excited fluorescence images of HepG2 and SH-SY5Y cells. (1) and (5):Bright-field images of cells. (2) and (6):One-photon excited fluorescence images of cells after 2 h incubation with NHP(5 μmol/L) or DMSO( λex=400 nm, PMT:500~600 nm), respectively. (3) and (7):Two-photon excited fluorescence images of cells after 2 h incubation with NHP(5 μmol/L)and DMSO( λex=800 nm, PMT:500~600 nm), respectively. (4) and (8):The merged images of (1)/(3) and (5)/(7). Scale bar=15 μm

在确定化合物NHP细胞毒性较小的基础上,我们进一步检测了其在细胞和组织成像中的应用。 将终浓度5 μmol/L的化合物NHP分别加入HepG2和SH-SY5Y细胞培养液共培养2 h,用PBS缓冲溶液洗3次后,利用双光子共聚焦显微镜观察化合物NHP的细胞成像情况。 结果表明,加入化合物NHP后,在单光子和双光子激发下,细胞内呈现绿色荧光,而同样成像条件下对照组(DMSO)则无任何荧光(图3 C和3D)。 表明化合物NHP可用于单光子和双光子荧光细胞成像。

为了验证化合物NHP在组织水平的成像效果,我们使用配置好的Hepes溶液配制了10 μmol/L的NHP,并与分离的果蝇脑组织孵育2 h,用PBS缓冲溶液冲洗3次,利用双光子荧光共聚焦显微镜观察化合物NHP在果蝇脑组织的成像情况。 结果显示,同样成像条件下对照组(DMSO)果蝇脑组织无荧光信号,而在加入化合物NHP的果蝇脑组织中,可以观察到明显的绿色荧光(图4)。 结果表明,化合物NHP不仅可以应用于细胞成像,也可以用于果蝇的脑组织成像,为扩展其生物应用奠定了基础。

图4 果蝇大脑双光子荧光成像图。( A)和( D)为果蝇大脑的DIC图;( B)和( E)为果蝇大脑与NHP(10 μmol/L)2 h共孵育的双光子荧光成像图( λex=800 nm, PMT:500~600 nm);( C)和( F)为(1)/(3)和(5)/(7)的重叠图。标尺为100 μmFig.4 Two-photon images of Drosophila brain with NHP. ( A) and ( D)Bright-field images of Drosophila brain; ( B) and ( E):Two-photon images of Drosophila brain after 2 h incubation with 10 μmol/L compound NHP( λex=800 nm, PMT:500~600 nm) and DMSO. ( C) and ( F):The merged images of (1)/(2) and (4)/(5). Scale bar=100 μm

3 结 论

本文通过简单高效的有机合成,得到了一种含嘧啶基的双光子荧光化合物2-[(1 E)-2-[4-(二甲氨基)苯基]乙烯基]-6-甲基-4(3 H)-嘧啶(NHP),其具有良好的发光性能和较大的双光子吸收截面,并且在复杂生理环境中发光性质稳定,不受pH值、离子和氨基酸等外部因素的影响。 二甲氧唑黄(XTT)比色法检验结果表明,化合物NHP具有较小的生物毒性;生物成像实验结果表明,化合物NHP可以用于细胞和果蝇脑组织的单光子和双光子荧光成像,在生物医学研究中具有潜在的应用价值。 本文为设计合成在复杂生理环境中发光性质稳定的双光子荧光染料提供了理论和实验依据。

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