AR2000型应力控制流变仪(美国T.A. Instruments公司);电感耦合等离子体质谱(ICP-MS,美国Thermo Scientific公司)。 顺铂(≥98.5%)购自于山东铂源化学有限公司);泊洛沙姆407(P407, M_w=12000),泊洛沙姆188(P188, M_w=8600)购自于国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜为分析纯试剂,购自北京化学试剂厂。

昆明种小鼠24只(雌性,4周龄,体重(18.2±2.0) g)购自哈尔滨医科大学动物饲养中心。 所有的动物实验都遵照国务院颁发实验动物管理条例办法实施。

用冷却法制备泊洛沙姆温敏凝胶^[9]。 将去离子水冷却至4 ℃,在搅拌条件下,将不同质量配比的P407和P188缓慢加入水中,在冰水浴中,搅拌4 h,在4 ℃冰箱过夜,得到澄清透明的溶液,即空白泊洛沙姆温敏凝胶。

载顺铂凝胶的制备:称取质量为聚合物总质量1%的顺铂,用二甲基亚砜(DMSO)溶解后,加入空白凝胶中,冰水浴中搅拌4 h后,放置在4 ℃冰箱过夜,即可得到载有顺铂的泊洛沙姆温敏凝胶,按处方不同代号为F1~F9。

采用试管倒转法测试不同工艺处方的载药温敏凝胶的胶凝温度^[10]。 取0.5 mL溶液加入1 mL玻璃管中,置于20 ℃水浴中,以1 ℃/min速率缓慢升温。 每升高1 ℃,将玻璃管底部上下倒转,观察液体流动情况。 溶液完全不流动时为完全胶凝状态,此时的温度即为胶凝温度。

使用应力控制流变仪测试载药温敏凝胶F5的流变学性能,使用锥板夹具,锥板直径为40 mm。 以流体模式下分别在20和37 ℃进行检测分析,剪切速率从10~1000 s^-1递增,得到其相对应的剪切应力变化曲线。 在材料的线性粘弹区内,应力与应变成正比而储能模量保持不变。 在对材料进行振荡测试之前,首先确定其在20和37 ℃下的线性粘弹区域。 在保持压力条件不变的前提下,对样品进行扫频检测(平行板与圆盘的间隙为0.1 mm),频率0.1~10.0 Hz,得到各样品的储能模量 G'、耗能模量 G″和动态粘度 η'。

将2 mL载有质量分数为1%顺铂的泊洛沙姆凝胶F5加入已测定质量的5 mL西林瓶中,37 ℃水浴孵化10 min,使其完全凝胶化。 加入醋酸盐缓冲液2 mL作为释放介质(pH=5.0),37 ℃水浴恒温振荡,转速为70 r/min,每隔1 h将释放介质全部取出,擦干西林瓶外表面,称其质量并记录。 再加入2 mL释放介质。 相邻时间点样品的质量差为凝胶的溶蚀量。 累积溶蚀率( X)计算如下:

X/%=m0-mnm×100 (1)

式中, m₀为加入释放介质前凝胶与西林瓶的总质量(g), m_n为第 n次称重时凝胶与西林瓶的总质量(g), m为加入西林瓶的凝胶质量(g)。 以凝胶累积溶蚀率对时间作图,得凝胶溶蚀曲线。 重复3次,结果取平均值。

将取出的释放介质通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定其中的顺铂含量,计算药物累积释放百分率。

将鼠源宫颈癌U14细胞接种于昆明小鼠的腹腔中,7~10 d后形成癌性腹水。 用注射器抽取少量腹水,用PBS洗涤1~2遍后,用PBS配置成浓度为4×10⁶/mL的细胞悬液。 用胰岛素注射器抽取25 μL细胞悬液,探入雌性昆明小鼠的阴道,将细胞注射至抵近子宫颈处的阴道粘膜下^[11]。

肿瘤细胞接种3 d后,将荷瘤小鼠随机分成4组,每组6只小鼠,分别为1组:载药温敏凝胶组,将小鼠用戊巴比妥麻醉后,向阴道内灌注20 μL载药凝胶F5,其中顺铂含量为0.054 mg。 2组:空白凝胶组,向小鼠阴道内灌注20 μL空白未载药凝胶。 3组:系统化疗组,经小鼠尾静脉注射顺铂水溶液。 水溶液中顺铂含量与凝胶中顺铂含量相等。 4组:空白对照组,无任何治疗。 其中1、2、3组隔日给药1次,共给药3次。

每隔3 d称量小鼠的体重,记录体重变化。于给药后第15 d处死所有动物,剖取瘤体,称重,拍照。 4%(质量分数)多聚甲醛固定,石蜡包埋切片病理检查。

抑瘤率的计算公式:

X/%=mc-mnmc×100 (2)

式中, m_c为对照组肿瘤平均重量(g), m_n为治疗组肿瘤平均重量(g)。

实验所得数据应用SPSS11.5统计软件进行处理,方差分析检验。 P<00.05表示差异有统计学意义。

将普通非温敏凝胶应用于阴道疾病时,凝胶泄漏是一个常见问题。温敏凝胶在低于相转变温度时为液态,有利于给药,而在高于相转变温度时则转变为固态,可长时间地停留在阴道内而不会漏出。 合适的胶凝温度应当为30~36 ℃。 如果胶凝温度过高,凝胶进入阴道后在生理温度下仍然保持液态,容易导致药物泄漏。 而过低的胶凝温度则导致药物在室温下即已形成凝胶,难以给药^[12]。

在本研究中,通过调节P407和P188的比例来控制载药温敏凝胶的胶凝温度。 胶凝温度随P407的质量分数增大而下降,P188的质量分数增大则上升。表1中的结果显示,配方F5(P407和P188的质量分数分别为22%和5%)在室温下为液态,而在略低于生理温度时(35 ℃)转变为半固态凝胶,可有效实现化疗药物顺铂在阴道的局部递送。 因此,配方F5被用于以下的研究中。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 载有顺铂的泊洛沙姆凝胶的胶凝温度 Table 1 Gelation temperature of cisplatin-loaded poloxamer gel(cisplatin/gel) Formulation w(P407)/% w(P188)/% w(Cisplatin)/% Gelation temperature/℃ F1 20 0 1 27 F2 20 5 1 41 F3 20 10 1 47 F4 22 0 1 24 F5 22 5 1 35 F6 22 10 1 42 F7 24 0 1 23 F8 24 5 1 32 F9 24 10 1 37

表1 载有顺铂的泊洛沙姆凝胶的胶凝温度 Table 1 Gelation temperature of cisplatin-loaded poloxamer gel(cisplatin/gel)

温敏凝胶进入阴道后,其流变学性质对药物在阴道中的分布和保留具有重要意义。图1为载药凝胶的粘度随剪切速率和温度变化的关系。 载药凝胶在20 ℃为牛顿流体,而在37 ℃则呈现假塑性流动,与胶凝温度的测试结果一致。

图1

Fig.1

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	图1 载有顺铂的温敏凝胶(配方F5)在20和37 ℃ 的流变曲线Fig.1 Flow curves of cisplatin/gel(F5) at 20 ℃ and 37 ℃

表2显示了载药凝胶在20和37℃ 时的储能模量、耗能模量及动态粘滞度随频率的变化。 其中,储能模量( G')用来表征载药凝胶的弹性特征,它代表了载药凝胶变形后回复形状的能力。 耗能模量( G″)用来表征载药凝胶的黏性特征,它代表了载药凝胶抵抗流动的能力。 在20 ℃时,在所有频率下, G″均大于 G',说明载药凝胶为弹性流体。 随着温度升高到37 ℃, G'和 G″均显著增大,但 G″的增长速度小于 G'。 在整个扫描频率范围内, G'均超过 G″,说明此时为半固体凝胶状态,具有良好的弹性响应性。 动态粘度则代表了流体内部抵抗流动的阻力,载药凝胶在低振荡频率下为典型的粘弹性体系。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 载顺铂温敏凝胶的储能模量、耗能模量和动态粘滞度随温度变化的影响 Table 2 Effect of temperature on the storage modulus( G'), the loss modulus( G″),and the dynamic viscosity( η') of cisplatin/gel Temperature /℃ G'/Pa at representative oscillatory frequencies 0.50 Hz 5.00 Hz 10.00 Hz Storage modulus( G')/Pa 20 0.19±0.02 1.48±0.08 3.213±0.04 37 16998±1.99 24685±3.44 25012±2.08 Loss modulus( G″)/Pa 20 1.58±0.05 12.01±0.07 24.05±0.07 37 6265±3.04 1792±3.07 1086±3.07 Dynamic viscosity( η')/(Pa·s) 20 0.42±0.02 0.38±0.07 0.38±0.04 37 1699.00±1.99 57.79±0.14 17.38±0.02 *Each value represents the mean(±SD) of three replicates.

表2 载顺铂温敏凝胶的储能模量、耗能模量和动态粘滞度随温度变化的影响 Table 2 Effect of temperature on the storage modulus( G'), the loss modulus( G″),and the dynamic viscosity( η') of cisplatin/gel

药物从凝胶中释放主要有两种方式:一种为被动扩散;另一种为随凝胶溶蚀而逐渐释放。 本文采用醋酸盐缓冲液来模拟阴道中的酸性环境,考察载药凝胶在缓冲液中的体外溶蚀和体外释放。 由图2可知,在6 h时,凝胶溶蚀率和药物释放率均达到约90%,以累积释药率( Y)对累积溶蚀率( X)作图,得到回归方程为 Y=0.9736 X-0.0281)( R²=0.9956),线性关系良好,且拟合方程的斜率接近1,表明凝胶溶蚀和凝胶中顺铂的释放有很高的相关性,说明凝胶溶蚀是控制药物释放的主要方式。

图2

Fig.2

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	图2 载顺铂温敏凝胶(配方F5)的体外溶蚀和体外药物释放曲线Fig.2 In vitro erosion curve( A) and in vitro drug release curve( B) of cisplatin/gel(F5)

阴道药物递送系统近年来获得了飞速发展,其剂型包括片剂、栓剂、阴道环、溶液、乳剂、凝胶,等^[13]。 但较少有研究将其用于宫颈癌的局部化疗。 局部化疗相对传统系统化疗而言具有以下优势: 1)稳定载入的药物分子,使其保持抗癌活性; 2)控制并延长药物释放时间,确保药物充分扩散,并在肿瘤细胞的多个分裂期间被吸收进入癌细胞; 3)能够担载和释放疏水性药物; 4)直接输送药物到病灶处,减少药物浪费; 5)避免药物进入体循环,减少药物副反应^[14]。 因此,在本研究中,我们尝试将温敏凝胶用于治疗宫颈癌,希望得到一种高效低毒的经阴道给药途径的局部化疗剂型。

图3 A的结果表明,向荷有原位宫颈/阴道癌的小鼠阴道内灌注空白凝胶或载有顺铂的温敏凝胶,对小鼠体重均无明显的影响,体重始终保持增长,而接受顺铂静脉注射的小鼠则均有一定程度的体重下降。 有学者将载有荧光染料的温敏凝胶灌入小鼠阴道,结果荧光染料主要蓄积在阴道。 给药后6 h,阴道中荧光信号强度分别是肝脏的100倍,肾脏的25倍^[15]。 因此,通过阴道递送化疗药物的缓释剂型可有效地避免静脉注射化疗药物所导致的系统毒性。

图3

Fig.3

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	图3 小鼠给药后15 d中的体重变化曲线( A)。 小鼠给药后15 d的肿瘤剖检照片( B)、肿瘤重量( C)和抑瘤率( D)Fig.3 The body mass curve of mice( A), the photographs( B), tumor mass( C) and tumor inhibition rate( D) of ex vivo reproductive tracts(including tumor) 15 days after drug administration 1.cisplatin/gel; 2.cisplatin/i.v; 3.blank gel; 4.control

在给药后14 d,所有动物被处死,瘤体被剖取并称重。 肉眼可见空白凝胶组和空白对照组的小鼠均有巨大的生殖道肿瘤形成,而载药凝胶组和静脉注射组的肿瘤体积远小于对照组(图3 B)。

肿瘤称重结果表明,载药凝胶组、空白凝胶组、静脉注射组和空白对照组的肿瘤平均质量分别为(0.58±0.31)、(0.77±0.72)、(1.6±0.94)和(1.57±0.67) g(图3 C)。 空白凝胶组和空白对照组的肿瘤平均质量与载药凝胶组和静脉注射组相比有显著差异( P<0.001),载药凝胶组与静脉注射组之间无统计学差异( P>0.05)。 而抑瘤率结果表明,载药凝胶组、静脉注射组、空白凝胶组的抑瘤率分别为63.1%、51.0%、-1.91%(图3 D)。

病理切片结果显示,空白凝胶组和空白对照组中的小鼠瘤体生长旺盛,细胞核浓染分裂。 而载药凝胶组和静脉注射组中组织样本中的肿瘤生长区域相对较小,并可见正常的阴道组织(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 小鼠给药15 d后的肿瘤病理切片(H&E染色)Fig.4 Histopathological observation of ex vivo tumors 15 days after drug administration A.cisplatin/gel; B.cisplatin/i.v.(intravenous injection); C.blank gel; D.control