生物素(biotin)修饰的多肽A β_1-16(biotin)(序列为GK(biotin)G DAEFR HDSGY EVHHQ K),A β_1-42(序列为DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLM VGGVV IA)购于上海楚肽生物,链霉亲和素购于美国Promega公司,邻联茴香胺( o-dianisidine dihydrochloride,ODAD)、抗坏血酸、CuSO₄购于阿拉丁公司,辣根过氧化物酶(HRP)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购于北京鼎国公司,待筛选的化合物(1:EDTA;2:组氨酸;3:氯碘羟喹;4:喹啉;5:8-氨基喹啉;6:5-磺酸-7-碘-8-羟基喹啉;7:5,7-二碘-8-羟基喹啉;8:2,2'-联吡啶;9:5,5'-二甲基-2,2'-联吡啶;10:4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶;11:6,6'-二甲基-2,2'-联吡啶;12:2,2'-联喹啉;13:氯四环素)分子结构及购买厂家列于辅助材料图S1中,以上化合物均为分析纯,实验用水为Milli-Q水(18.2 MΩ·cm)。 BioTek® Powerwave XS2型可见光谱记录仪(英国BioTek公司),JEOL 2000FX型透射电子显微镜(TEM,日本JEOL公司)。

1.2.1 抑制剂筛选 根据文献报道^[24,25],合成链霉亲和素修饰的纳米金探针(记为SA-GNPs),在1 mL A β_1-16(biotin)溶液中加入不同量的CuSO₄溶液和不同浓度的待筛化合物,在37 ℃下反应72 h,将40 μL上述溶液与160 μL SA-GNPs(3 nmol/L)充分混匀,反应30 min后,记录溶液400~800 nm处可见吸收光谱。

1.2.2 TEM测定 1 g/L的A β_1-42溶液中加入适量CuSO₄溶液和待筛化合物,在37 ℃下反应72 h,取10 μL上述样品滴到铜网上,室温自然干燥后,滴加10 μL 1%(质量分数)的磷钨酸,静置1 min,水洗3次,室温自然干燥后,在TEM上测定样品形貌。

1.2.3 H₂O₂检测 依据文献报道^[26,27],4 mg/L的A β_1-42、1 μmol/L CuSO₄、10 μmol/L抗坏血酸和不同浓度的待筛化合物溶于50 μL HEPES溶液中,充分混匀,37 ℃反应72 h,加入50 μL 1.8 mmol/L ODAD、10 μL 1.2 g/L的HRP和190 μL的HEPES,充分混匀,1 min后,测定溶液在450 nm处的吸光度。

图1所示为A β聚集抑制剂的筛选过程及其应用。 Cu²⁺与A β_1-16(biotin)单体相互作用形成A β_1-16(biotin)-Cu²⁺复合物,并进一步形成聚集体,当加入SA-GNP探针时,由于探针上的链霉亲和素与聚集体表面大量的生物素分子特异性的相互作用,使GNP也形成聚集体,导致溶液颜色由红色变为蓝紫色,溶液光谱发生明显红移^[28,29]。 当抑制剂存在时,Cu²⁺与A β_1-16(biotin)的相互作用被抑制或者A(聚集时的构象变化被抑制,导致A β_1-16(biotin)-Cu²⁺聚集体的形成量大大减少,再加入SA-GNP时,溶液颜色保持红色,溶液光谱红移程度降低^[24],基于此,可以对化合物的抑制能力与其构型间的关系进行定量分析。

图1

Fig.1

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	图1 实验原理示意图Fig.1 The schematic presentation of experiment

由于长链的A β_1-42为水溶性较好的A β_1-16和疏水性较强的A β_17-42的复合体,因此其聚集能力比A β_1-16更强,易于在溶液中自发形成纤维状聚集体,在Cu²⁺存在时其聚集能力大大加强,聚集速度也明显加快,易于形成无定形淀粉样蛋白聚集体,具有很强的细胞毒性,与AD的发病有直接联系^[5],因此研究抑制剂对A β_1-42的聚集尤其是Cu²⁺诱导的A β_1-42聚集过程的抑制具有更加重要的意义。 我们利用上述筛选出的抑制剂分别对Cu²⁺诱导的A β_1-42聚集体及ROS(以H₂O₂为例)的形成过程进行抑制。

本文中选取的13种化合物,可以分为:1)传统金属离子螯合剂,如EDTA(1);2)构成A β多肽的氨基酸,如组氨酸(2);3)曾用于治疗AD的药物,如氯碘羟喹类化合物(3~7);4)能与Cu²⁺形成五元环的邻菲咯啉类化合物(8~12);5)四环素类药物,如氯四环素(13)。 根据上述实验原理中提及的基于纳米金探针的可见吸收光谱法,以溶液光谱527和650 nm处吸光度比值(OD_{527 nm}/OD_{650 nm})对化合物浓度作图,获得了各化合物的抑制曲线,见图2,并从拟合的抑制曲线上获得了不同化合物的半抑制浓度(half inhibitory concentration,IC₅₀),见表1。

图2

Fig.2

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	图2 加入不同种类抑制剂后纳米金溶液OD527 nm/OD650 nm随抑制剂浓度的变化Fig.2 The changes of OD527 nm/OD650 nm of SA-GNPs with Cu2+ induced A β1-16(biotin) aggregates by adding different amounts of inhibitors 1, 2 and 13( A); 3~7( B); 8~12( C) to the system, respectivelyThe concentration of A β1-16(biotin) is 2.0 mg/L, and the concentration of Cu2+ is 1.0 μmol/L, respectively. The error bars are standard deviations( n=3)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同化合物对Cu2+诱导的A β聚集作用IC50值 Table 1 IC50 values of potential inhibitors for Cu2+ induced A β aggregation Compound IC50 value for A b-Cu2+/(mmol·L-1) Compound IC50 value for A b-Cu2+/(mmol·L-1) 1 0.8 a 8 1.5 a 2 8.1 a 9 2.0 a 3 1.0 a 10 1.5 a 4 - 11 33.0 a 5 - 12 - 6 0.9 a 13 28.0 a 7 2.1 a a. The IC50 values obtained by GNP-based assay in the presence of 2.0 mg/L A β1-16(biotin) and 1.0 μmol/L Cu2+.

表1 不同化合物对Cu2+诱导的A β聚集作用IC50值 Table 1 IC50 values of potential inhibitors for Cu2+ induced A β aggregation

从图2可知,随着待筛化合物(1~3、6~11、13)浓度增加,溶液光谱吸光度比值OD_{527 nm}/OD_{650 nm}逐渐增加,说明这类化合物可以一定程度上抑制Cu²⁺与A b的相互作用,减少A β聚集体的生成。 另一方面,即使溶液中存在较高浓度的化合物(4、5、12),溶液光谱吸光度比值也没有明显变化,说明这类化合物不能有效地抑制Cu²⁺诱导的A β聚集。表1中根据拟合曲线获得的IC₅₀值能够对不同化合物的抑制能力进行定量分析。

进一步对以上结果进行分析,对抑制剂的抑制能力与其分子结构间的关系进行研究,初步获得以下结论:Ⅰ)从化合物1和2的比较可知,EDTA(1)中含有4个—COOH,而组氨酸(2)中只含有一个—COOH,其抑制能力存在明显差异,说明分子内—COOH的数量越多,与Cu²⁺的配位能力越强,抑制Cu²⁺诱导A β聚集的能力越强;Ⅱ)由于A β中能与Cu²⁺相互作用的氨基酸主要是组氨酸,溶液中加入的组氨酸(2)与A β有竞争性作用,从而减弱了A β与Cu²⁺的相互作用,进而起到抑制作用;Ⅲ)对于喹啉类化合物(3~7),—OH对于化合物的抑制能力是必需的,当—OH被—H或—NH₂取代(例如化合物4和5)时,化合物的抑制能力完全消失,原因可能是—OH与N能够与Cu²⁺形成五元螯合环,从而抑制A β与Cu²⁺的相互作用,当—OH缺失时,五元环无法形成,因此抑制能力大大降低;Ⅳ)对于邻菲咯啉类化合物(8~12),侧链基团的位置不同,抑制剂的抑制能力也会受到明显影响,例如当—CH₃位于对位(化合物10)或被—H取代(化合物8)时,由于空间位阻较小,其抑制能力较强,IC₅₀值较低;而当—CH₃位于间位(化合物9)或邻位(化合物11)时,化合物的抑制能力逐渐降低,原因可能是—CH₃的存在使空间位阻逐渐增加,影响其与Cu²⁺的相互作用。 对于化合物12(双喹啉),相比与—CH₃,苯环结构的存在带来的空间位阻更大,因此,其抑制能力完全丧失; Ⅴ)化合物的溶解度对其抑制能力也存在一定影响,例如化合物6侧链为亲水性的—SO₃H,使化合物的水溶性增加,化合物7侧链被-I取代,水溶性降低,他们的抑制能力在同系列化合物中分别是最强和最弱,对于化合物12,由于苯环的存在,水溶性很差,其抑制能力在同系列化合物中也是最弱的,原因可能由于亲水性好的化合物分子更容易与Cu²⁺和A β接触,容易形成螯合物,从而提高了其对Cu²⁺的络合能力以及从A β-Cu²⁺络合物中竞争性结合Cu²⁺的能力; Ⅵ)化合物本身的分子构型对其抑制能力也有明显影响。 例如,尽管化合物13(氯四环素)中没有能与Cu²⁺形成螯合物的结构,但由于其分子为平面结构,能够直接与A β发生相互作用,结合到A β表面,从而阻碍了A β与Cu²⁺的接触,化合物的平面刚性构型也抑制了A β构型发生变化,从而具有一定的抑制作用。 因此,增加化合物中—COOH数量,减少螯合剂的空间位阻;设计增加能形成多元环结构的螯合单元;引入亲水性取代基,增加化合物水溶性;引入组成A β的氨基酸取代基,如组氨酸或酪氨酸;通过改变分子骨架结构,使化合物具有刚性平面结构,对于AD药物的开发将起到指导性作用。 在本研究中,只是初步选取了5类13种化合物,对于其分子构效关系的研究还不够深入,在后续研究中,增加待筛选化合物种类,改变化合物取代基结构和取代位点,同时在每个分类中增加化合物的数量将会对于药物的筛选具有更大意义,同时有望寻找到更为有效的抑制A β聚集的抑制剂,提出更合理的抑制机理。

为了进一步验证前述利用纳米金探针筛选出的抑制剂及AD药物设计原则的有效性,利用TEM观察了抑制剂对Cu²⁺诱导A β_1-42聚集体形貌的改变。 如图3所示,A β_1-42能够在溶液中自发缓慢聚集形成纤维状聚集体(图3 A)^[5],Cu²⁺可以加速A β_1-42的聚集,促使无定形聚集体的形成(图3 B),根据上述光谱实验中的结果,参考各化合物的抑制能力(化合物1≅3>8>2>13),在含有Cu²⁺和A β_1-42的溶液中加入不同浓度的抑制剂(由于A β_1-42浓度约为A β_1-16(biotin)的10倍,此处所用抑制剂浓度略大于10×IC₅₀值),当分别加入EDTA(1)和组氨酸(2)时,无定形聚集体的生成被抑制,最终样品形貌与不含有Cu²⁺的A β形貌类似(图3 C、3 D),当分别加入化合物3、8和13时,不仅无定形聚集体的生成被抑制,而且纤维状聚集体的量也明显减少(化合物3和8)甚至完全消失(化合物13)(图3 E~G),说明这些化合物不仅能抑制Cu²⁺与A β_1-42的相互作用,减少无定形聚集体的产生,而且由于分子上相对刚性的六元环结构的存在,一定程度上也抑制了A β_1-42本身构型的变化^[30]。 以上现象表明我们基于A β_1-16筛选出的抑制剂同样可用于抑制Cu²⁺诱导的A β_1-42聚集体的形成。

图3

Fig.3

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图3 抑制剂对A β1-42聚集体形貌的改变Fig.3 Regulation the morphology of A β1-42 by selected inhibitorsTEM micrographs of A β1-42( A), Cu2+ induced A β1-42 aggregates( B), Cu2+ induced A β1-42 aggregates in the presence of 10 μmol/L compd 1( C), 100 μmol/L compd 2( D), 10 μmol/L compd 3( E), 20 μmol/L compd 8( F), and 300 μmol/L compd 13( G), respectively. The scale bars indicate 100 nm. The concentration of A β1-42 is 40.0 mg/L, and the concentration of Cu2+ is 10.0 μmol/L, respectively

由于Cu²⁺诱导A β_1-42聚集伴随产生ROS,对神经元造成氧化性损伤^[5],又对筛选出的化合物抑制溶液中ROS(以H₂O₂为例)产生的能力进行了研究(见辅助材料图S2)。 如图4所示,Cu²⁺和A β_1-42同时存在时,溶液中H₂O₂浓度达到12.5 μmol/L,而当加入不同浓度的化合物时,随着筛选出的化合物(1、2、3、6、7、8、9、10、11、13)浓度增加,溶液中H₂O₂浓度明显降低,证实了筛选出的抑制剂具有减少ROS产生的能力。 同时,前述可见光谱法中确定的没有抑制能力(化合物4、5、12)的化合物不能明显减少溶液中H₂O₂的产生(见图S3),证实了基于纳米金探针筛选Cu²⁺诱导的A β聚集抑制剂的有效性。

图4

Fig.4

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图4 抑制剂对H2O2产生量的影响Fig.4 The effect of screened inhibitors on the production of H2O2 produced by the interaction of Cu2+ and A β1-42The concentrations of inhibitor are its 0.1×IC50, 1×IC50 and 10×IC50 values, respectively. The IC50 values were calculated by the linear relationship between IC50 values and the concentration of A β1-16(biotin). The concentration of A β1-42 is 4.0 mg/L-1, and the concentration of Cu2+ is 1.0 μmol/L, respectively. The error bars are standard deviations( n=3)