研究了大叶黄杨叶、茎、果挥发油的化学成分及抗病毒活性。 采用超临界二氧化碳萃取,应用气相色谱-质谱联用(GC-MS) 法鉴定挥发油化学成分,考察体外抗病毒作用。 共鉴定133个化合物,大叶黄杨叶挥发油中主要有2-乙氧丙烷(41.92%)、( E)-2-己烯-1-醇(17.8%)、 ( E)-香叶醇(7.86%)、甲基环己烷(6.60%)等;大叶黄杨茎挥发油中主要有甲氧基苯基肟(33.10%)、二十八烷(14.34%)、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇(12.48%)、甲苯(11.88%)、二十一烷(7.74%) 等;大叶黄杨果挥发油中主要有苯甲醛(15.52%)、甲苯(15.03%)、甲基环己烷(14.76%)、( Z)-3-己烯-1-醇(10.98%)等。 大叶黄杨叶、茎、果的环己烷、乙醚萃取挥发油对特定病毒有显著抑制效果。 大叶黄杨叶、茎、果中挥发油萃取部位成分差异明显,有特定抗病毒活性。
To analyze the chemical constituents of the essential oils of leaf, stem, and fruit from Euonymus japonicus Thunb. and study their antiviral activities, the volatile oils were extracted by supercritical carbon dioxide and were separated and identified by GC-MS. Their antiviral activities in vitro were inspected. There are 133 components identified, in which the main constituents are 2-ethoxy-propane(41.92%), ( E)-2-hexen-1-ol(17.80%), ( E)-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol(7.86%), methyl cyclohexane(6.60%) from the leaf volatile oil, methoxy phenyl oxime(33.10%), octacosane(14.34%), α-methyl- α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol(12.48%), toluene(11.88%)and heneicosane(7.74%) from the stem volatile oil and benzaldehyde(15.52%), toluene(15.03%), methyl cyclohexane(14.76%) and ( Z)-3-hexen-1-ol(10.98%) from the fruit volatile oil. The volatile oils of the leaf, stem and fruit extracted by cyclonexane and ether show special inhibiting activities against some viruses. Chemical compositions of the volatile oils of the leaf, stem, and fruit show significant differences and special antiviral activities.
大叶黄杨( Euonymus japonicus Thunb.)又名“冬青卫矛”,来自卫矛科卫矛属常绿灌木或小乔木[1]。 大叶黄杨具有生长快、易繁殖、耐修剪、抗寒、抗旱、抗贫瘠特征,对各种有毒气体及烟尘都有很强的抵抗能力, 可作绿篱、几何造型、大色块造型、孤植等多种种植形式,在城市道路景观和园林绿化中广泛使用,具有显著的生态学和经济学价值[2]。 国内外研究表明,采用大叶黄杨叶为原料进行制备叶绿素铜钠盐[3],广泛应用于食品、医药行业。 从其根皮乙酸乙酯提取物中分离出芳香萜类、鞘糖脂类羽扇豆醇、豆甾醇、谷甾醇、 β-胡萝卜素[4,5]和具有杀粘虫的倍半萜类化合物ejaponineA、ejaponine B[6],同时,大叶黄杨作为一种药用植物,具有祛风湿、强筋骨、活血止血的功效,可治疗风湿痹痛、腰膝酸软、跌打伤肿、骨折、吐血等疾病[7]。 国内研究已发现麻叶千里光挥发油成分可延缓副流感病毒、流感病毒致细胞病变作用[8],荆芥挥发油具有抗甲型流感病毒作用[9],鱼腥草挥发油具有抗流感病毒[10]。 本文对大叶黄杨叶、茎、果实挥发油成分研究,探索其抗病毒活性,以期为其应用开发提供一定基础。
大叶黄杨叶、茎、果于2014年5月采自安徽合肥大蜀山地区,经安徽新华学院李启照副教授鉴定来自大叶黄杨( Euonymus japonicus Thunb.);腺病毒3型(Ad3)、甲型流感病毒FM1株、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)株、柯萨奇病毒B3(CVB3)和伪狂犬病病毒(PRV)Bartha株购于中国医学科学院北京病毒研究所。 其它试剂均为分析纯。
HA221-50-01型超临界二氧化碳萃取设备(江苏南通华安超临界有限公司);Agilent 6890-5973N型气相色谱仪(美国安捷伦公司)。
1.2.1 挥发油的提取 分别取干燥粉碎后的大叶黄杨叶、茎、果各250 g装入料筒,放入超临界二氧化碳萃取装置萃取釜内,设置萃取压力40 MPa,萃取温度30 ℃,萃取流量20 L/h,萃取3 h后,打开分离釜排料阀,收集萃取物。 萃取物经减压蒸馏后分别以环己烷、乙醚萃取,N2气吹去溶剂,得到挥发油,环己烷层挥发油几近无色,乙醚层挥发油呈淡黄色,3次萃取,以油重/样品重得大叶黄杨叶环己烷、乙醚萃取挥发油得率为0.88%、1.11%,大叶黄杨茎经环己烷、乙醚萃取挥发油得率为0.52%、0.96%,大叶黄杨果经环己烷、乙醚萃取挥发油得率为0.41%、0.73%。
1.2.2 色谱条件 HP-5 MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯He气,不分流,进样量1 μL;程序升温,柱起始温度为40 ℃,保持1 min后以5 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min升至280 ℃,保持7 min,再以5 ℃/min升至300 ℃,保持至完成分析。 电子轰击能量60 eV,扫描范围 m/z 25~550,离子源温度220 ℃,接口温度280 ℃,全离子扫描[11]。 通过面积归一化法测定鉴定的化合物的相对含量,检索为数据库Nist2011。
1.2.3 抗病毒实验 将大叶黄杨叶、茎、果挥发油以无水乙醇分别稀释成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L,以利巴韦林为阳性对照药以无菌水稀释成相同浓度。 待96孔板细胞长成完整单层细胞后,弃去上清液,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次。 按50 μL/孔加入6种病毒,置于CO2培养箱中37 ℃培养1 h。 选用受试样品的最大无毒浓度(TC0)为最高浓度,以病毒生长液作连续倍比稀释,加入含不同浓度药物的病毒生长液100 μL/孔,同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和阳性对照组,每个浓度做4个复孔。 每日按常规于倒置显微镜下观察试验细胞病变状态,记录体外病变效应(CPE)如下:无CPE为“-”;25%细胞出现病变为“+”;25%~50%细胞病变为“++”;50%~75%细胞病变为“+++”;75%~100%的细胞病变为“++++”[12]。 平行实验3次,取平均值。
大叶黄杨叶、茎、果挥发油不同萃取部分总离子流图见图1,Nist图谱检测结果见表1。 由表1可知,从大叶黄杨叶、茎、果挥发油中共鉴定出133种化学成分,主要有烃类、酯类、苯类、醇类、醛类、酮类、杂环、酸类、醚类等。 在大叶黄杨叶环己烷萃取挥发油中共鉴定出48种挥发性成分,占总挥发性成分的71.24%,主要是醇类(31.40%)、烃类(19.78%)、酯类(8.96%)、苯类(7.94%)。 醇类化合物中主要有( E)-2-己烯-1-醇(17.8%)、( E)-香叶醇(7.86%);烃类化合物中主要有甲基环己烷(6.60%)、叔己基过氧化氢(4.00%)、二十八烷(4.08%);酯类化合物中主要有邻苯二甲酸二丁酯(2.84%);苯类化合物中主要有甲苯(6.54%)。 在大叶黄杨叶乙醚萃取挥发油中共鉴定出62种挥发性成分,占总挥发性成分的80.16%,主要是烃类(51.11%)、醇类(13.73%)、酯类(6.59%)。 烃类中主要有2-乙氧丙烷(41.92%)、十六碳酰胺(3.08%);醇类中主要有2,3-丁二醇(4.81%);酯类中主要有2-丁基-5-甲基-2-己烯酸乙酯(1.97%)、骆驼蓬碱乙烯酯(1.41%)。
![]() | 表1 大叶黄杨叶、茎、果挥发油不同部位化学成分 Table 1 Volatile oils' chemical constituents of leaf, stem and fruit from Euonymus japonicus Thunb. |
在大叶黄杨茎经环己烷萃取挥发油中共鉴定出32种挥发性成分,占总挥发性成分的63.63%,主要是烃类(26.34%)、苯类(15.45%)、醛类(13.35%)、酯类(9.93%)、醇类(9.33%)。 烃类中主要有二十八烷(14.34%)、二十一烷(7.74%);苯类中主要有甲苯(11.88%);醛类中主要有十八醛(2.67%)、2-溴十八醛(2.07%);酯类化合物中主要有邻苯二甲酸二丁酯(4.14%);醇类中主要有(-)- cis-桃金娘烯醇(3.21%)、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇(2.55%)。 在大叶黄杨茎乙醚萃取挥发油中共鉴定出28种挥发性成分,占总挥发性成分的 64.69%,主要是苯类(34.04%)、醇类(18.63%)等。 苯类中主要有甲氧基苯基肟(33.10%)。 醇类中有 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇(12.48%)、1-丙氧基-2-丙醇(3.06%)。
在大叶黄杨果经环己烷萃取挥发油中共鉴定出38种挥发性成分,占总挥发性成分的87.42%,主要是醇类(31.74%)、苯类(23.13%)、烃类(21.06%)、酯类(8.43%)。 醇类中主要有( Z)-3-己烯-1-醇(10.98%)、3-癸炔-2-醇(2.04%)、( S)-3-乙基-4-甲基戊醇(2.04%)、2-甲基-5-(1-甲基己烯基)-2-环己烯-1-醇(6.33%);苯类中主要有甲苯(15.03%)、乙苯(2.13%)、间二甲苯(4.23%);烃类中主要有甲基环己烷(14.76%)、二十一烷(2.64%);酯类化合物中主要有邻苯二甲酸二丁酯(4.74%)。 在大叶黄杨果乙醚萃取挥发油中共鉴定出54种挥发性成分,占总挥发性成分的80.96%,主要是醇类(23.90%)、烃类(22.30%)、醛类(16.64%)等。 醇类中主要有苯甲醇(4.82%)、2,3-丁二醇(4.64%)、3-(1-乙氧乙氧基)-2-甲基丁烷-1,4-二醇(3.52%);烃类中主要有二十一烷(5.36%)、二十八烷(3.86%);醛类中主要有苯甲醛(15.52%)。
大叶黄杨叶、茎、果经萃取后挥发油中共有成分有烃类(甲基环己烷、2,6,10-三甲基十四烷、十六碳酰胺、二十七烷、二十一烷、二十八烷),酯类(十六酸甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯),苯类(甲苯、乙苯、对二甲苯、甲氧基苯基肟、2,4-二叔丁基苯酚),醇类(( S)-3-乙基-4-甲基戊醇、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇、 trans-α, α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇),酮类(茉莉酮、 cis-六氢 -8 α-甲基 -1,8(2 H,5 H)-萘二酮、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮)。 其中叶、果中甲基环己烷含量远高于茎,分别达到6.60%和14.76%。 叶中十六酰胺、二十七烷含量高于茎、果,最高达3.08%和2.12%。 茎、果中二十一烷、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇含量高于叶,最高分别达7.74%、5.36%和2.55%、1.68%。 甲苯在叶、茎、果中含量均较高,且呈现依次增高的趋势,分别达到6.54%、11.88%、15.03%。 二十八烷、甲氧基苯基肟、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇以茎中含量最高,分别达到14.34%、33.10%、12.48%。 果中2,4-二叔丁基苯酚、( S)-3-乙基-4-甲基戊醇、苯甲醛含量最高,达到3.44%、2.04%、15.52%。
如表2所示,大叶黄杨叶经环己烷萃取后挥发油对柯萨奇病毒B3(CVB3)、腺病毒Ⅲ型(AdⅢ),乙醚萃取挥发油对甲型流感病毒(FM1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒B3(CVB3)有显著抑制作用;大叶黄杨茎经环己烷萃取后挥发油对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)、柯萨奇病毒B3(CVB3),茎乙醚萃取挥发油对呼吸道合胞病毒(RSV)、伪狂犬病病毒(PRV)抑制作用显著;大叶黄杨果经环己烷萃取后挥发油对甲型流感病毒(FM1)、伪狂犬病病毒(PRV),乙醚萃取挥发油对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)、柯萨奇病毒B3(CVB3) 抑制作用明显。
![]() | 表2 大叶黄杨叶、茎、果挥发油抑制病毒效应( n=3) Table 2 Antiviral effect aroused from essential oils of leaf stem and stem from Euonymus japonicus Thunb. |
从大叶黄杨叶、茎、果经环己烷萃取后挥发油中共鉴定出133种化学成分。 其中大叶黄杨叶挥发油中主要是烃类、醇类、酯类、苯类成分,包括2-乙氧丙烷(41.92%)、( E)-2-己烯-1-醇(17.80%)、( E)-香叶醇(7.86%)、甲基环己烷(6.60%)、甲苯(6.54%)、邻苯二甲酸二丁酯(2.84%)等。 大叶黄杨茎萃取挥发油主要是醇类、苯类、烃类、酯类成分,包括甲氧基苯基肟(33.10%)、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇(12.48%)、甲苯(11.88%)、二十八烷(14.34%)等。 大叶黄杨果萃取挥发油主要是苯类、醇类、烃类、醛类成分,包括苯甲醛(15.52%)、甲苯(15.03%)、甲基环己烷(14.76%)、( Z)-3-己烯-1-醇(10.98%)等。 叶、茎、果挥发油中有烃类、酯类、苯类、醚类相同成分23种(占17.29%),说明成分类型有显著差异。 不同部位含量差异较大,如叶中十六酰胺、二十七烷含量高于茎、果;茎、果中二十一烷、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇含量高于叶;二十八烷、甲氧基苯基肟、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇以茎中含量最高;果中2,4-二叔丁基苯酚、( S)-3-乙基-4-甲基戊醇、苯甲醛含量最高。
大叶黄杨叶、茎不同萃取挥发油对不同病毒有特殊抑制效果,与其挥发油成分和组成不同有关。 如大叶黄杨叶乙醚萃取挥发油中成分2-乙氧丙烷(41.92%)、2,3-丁二醇(4.81%)由于含量较高,可能是明显抑制甲型流感病毒(FM1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒B3(CVB3)的主要活性成分。 同样,大叶黄杨茎乙醚萃取挥发油中甲氧基苯基肟(33.10%)、 α-甲基 -α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇(12.48%)含量占据绝对优势,也可能是明显抑制呼吸道合胞病毒(RSV)、伪狂犬病病毒(PRV)的主要活性成分。 另外,大叶黄杨叶环己烷萃取和乙醚萃取挥发油、茎环己烷萃取挥发油和果乙醚萃取挥发油均对柯萨奇病毒B3(CVB3)具有明显抑制作用,从这4种挥发油组成看,可能与醇类和烃类的含量较高有关。
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