干式生化分析仪(利用反射光原理自制的全光谱仪器)、日立7180型全自动生化分析仪(日本日立公司); HPX-9162 MBE型电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂); SPH-211B型恒温培养摇床(上海世平实验设备有限公司);DF-1型集热式磁力搅拌器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂);MX-F型旋涡混合器(美国SCILOGEX公司);FYY25001-RO型基础应用型纯水机(青岛富勒姆科技有限公司);CO₂-CP、GLU、UA测定试剂盒均购于长春汇力生物技术有限公司;膜材料Grade 17 Chr(层析滤纸)、Grade40、Grade2(whatman公司)、膜材料N6、NLB-045(海宁市正大过滤设备有限公司)、膜材料NLW-100、NLW-80、SSWP(美国密理博(MILLIPORE)公司);标准血清。

1.2.1 高分子膜材料的筛选 通过对膜材料的载水量、通透性、流体扩散速度来进行膜材料的筛选。

1)载水量:载水量的研究主要是计算待筛选的膜单位面积内的饱和载水量, 检测方法如下:首先将高分子膜材料裁成10 mm×10 mm大小的正方形, 将其完全浸入去离子水中, 吸附饱和后取出用滤纸吸干高分子膜材料表面多余的水分, 分别称量高分子膜吸饱水前后的质量 m_前和 m_后, 计算质量差△ m, 根据水的密度以及膜的面积可得到高分子膜材料单位面积的饱和载水量。 测量3次取平均值。

2)流体扩散速度:流体扩散速度即为水在高分子膜材料中的扩散速度, 主要是计算滴加的水扩散到整张膜所需要的时间, 滴加的去离子水的量为膜的饱和载水量, 判断标准为水扩散到高分子膜的整个表面又没有溢出。 根据高分子膜材料的面积和测量时间即可得到单位时间内去离子水在膜中的扩散速度。 测量3次取平均值。

3)膜通透性:膜材料的通透性即为当高分子膜已经处于饱和水状态下, 继续滴加水后, 计算一定体积的去离子水透过高分子膜材料所需的时间t, 测量3次取平均值。

1.2.2 干片的制备 CO₂-CP检验原理为样品中的二氧化碳结合力在碳酸酐酶作用下, 使碳酸氢根分解, 引起pH值发生变化, 借助联合指示剂显色。 GLU检验原理为血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下, 生成过氧化氢, 用过氧化物酶将过氧化氢分解出氧的游离基, 它将4-氨基安替比林和酚氧化为红色的醌型化合物。 UA检验原理为血清中的尿酸在尿酸氧化酶的作用下, 生成过氧化氢, 用过氧化物酶将过氧化氢分解出氧的游离基, 它将4-氨基安替比林和酚氧化为红色的醌型化合物。

正常人体中二氧化碳结合力、葡萄糖、尿酸的浓度范围分别为23~29 mmol/L、3.9~6.2 mmol/L、208~428 μmol/L。只要不在这个范围内无论是偏高还是偏低均属于病变浓度。

干片的制备采用逐次滴加的方式, 不同种类干片制备过程中各参数也不同, 制备CO₂-CP干片时, 试剂加样量为40 μL, 干燥温度为37 ℃, 加样次数为5次;制备 GLU干片时, 试剂加样量为40 μL, 干燥温度为30 ℃, 加样次数为6次;制备UA干片时, 试剂加样量为40 μL, 干燥温度为25℃, 加样次数为8次。

1.2.3 干片标准色阶的制备 将二氧化碳结合力、葡萄糖、尿酸标准液按浓度梯度滴加到干片上, 显色后用数码相机拍摄, 图像经photoshop软件处理后分别得到标准色阶。

1.2.4 干式生化分析方法标准曲线的建立 使用全光谱干式生化分析仪测量二氧化碳结合力、葡萄糖、尿酸标准梯度溶液与各自干片反应后的反射光相对强度值, 分别建立与反射光相对强度之间的函数关系, 作为测量3种待测物质浓度的依据。

1.2.5 方法学评价 方法学评价主要包括加标回收实验、稳定性实验、重复性实验(批间和批内)和方法学比较。

对层析滤纸、Grade2(定量滤纸)、Grade40(无灰级定量滤纸)、N6(尼龙膜)、SSWP滤膜(混合纤维素酯)、NLB-045(尼龙表面膜)、NLW-80、NLW-100(尼龙网状膜主要用来帮助试剂扩散)等几种膜材料的载水量、流体扩散速度、通透性的研究如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 膜性能总结 Table 1 Summary of film properties Flim Aperture/μm Capacity/(μL·mm-2) Speed/(mm2·s-1) Permeability Tsigle/s Tdouble/s TNLW-80/s TNLW-100/s Grade40 8 0.177 0.018 2.09 3.07 1.36 1.23 Grade2 8 0.178 0.025 1.68 2.13 1.66 1.50 N6 6 0.076 0.46 8.05 16.58 6.93 3.21 NLB-045 0.45 0.083 0.17 5.59 11.13 4.21 3.66 SSWP 3 0.153 0.106 2.53 5.98 6.15 5.38 Grade17Chr - 0.76 0.02 2.785 4.49 3.43 2.38 NLW-80 80 - - 1.22 2.21 NLW-100 100 - - 1.055 2.03 Note: TNLW-80、 TNLW-100 represent the different films covered with NLW-80 and NLW-100; Tsingle、 Tdouble represent the permeability of the single film and the double file.

表1 膜性能总结 Table 1 Summary of film properties

高分子膜材料的筛选一般在载水量较高的前提下, 选择水扩散速度较快、通透性较好得膜材料, 因为膜的载水量越高吸附试剂越多, 能检测到待测物的浓度越低, 所制备的干片越灵敏;水在膜中的扩散速度越快, 说明样品在膜中的扩散速度越快, 使用这种膜制备的干片反应越迅速;处于水饱和状态下的高分子膜, 继续向其上滴加蒸馏水, 渗透得越快表示通透性越好。综合以上3种因素, 考虑选择层析滤纸为反应层, NLW-100为扩散层制作CO₂-CP、GLU、UA3种干片。

图1为3种干片的标准色阶图。 从图1可以看出, 3种干片显色均匀、色差明显, 达到前期应用的目的。

图1

Fig.1

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	图1 二氧化碳结合力、葡萄糖和尿酸标准色阶Fig.1 Standard color class of the CO2-CP, GLU and UA dry slide

此法制备干片的标准曲线横坐标为待测指标浓度, 纵坐标为反射光强度, CO₂-CP、GLU、UA所用标准品浓度分别为26、5.5和400 μmol/L;检测3种不同指标所选择的波长分别为580、490和580 nm;测量温度均为37 ℃;检测时间分别为60、60及20 s。图2即为干式生化分析方法测定标准曲线。 标准曲线的建立是以标准品为样本进行检测, 建立标准品浓度与反射光强度之间的函数关系, 由于与传统的透射光检测不同, 干片的检测方法为反射光度法, 因此所建立的标准曲线为对数标准曲线。

图2

Fig.2

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	图2 干式生化分析法测定GLU( A)、CO2-CP( B)、UA( C)的标准曲线Fig.2 Standard curve of analysis of GLU( A), CO2-CP( B) and UA( C) by dry chemistry method

2.4.1 加标回收率及相对标准偏差 以全自动生化分析仪测定阴性血清为样本, 做加标回收实验, 结果如表2所示, 干式生化分析法测定CO₂-CP加标回收率为101%~105%, 相对标准偏差(RSD)在3.77%~4.89%;测定GLU加标回收率为102%~104%, 相对标准偏差(RSD)在3.80%~4.96%;测定UA加标回收率为101%~104%, 相对标准偏差(RSD)在3.14%~4.61%, 表明该方法具有可行性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 干式生化分析法加标回收率和标准偏差(RSD) Table 2 Recoveries and RSD of dry chemistry method for CO2-CP, GLU and UA Serum sample Measured concentration/ (mmol·mol-1) Spiked concentration/ (mmol·L-1) Average measured concentration/(mmol·L-1) Recovery/% RSD/% ( n=3) CO2-CP 5.78 5 11.53 115 3.77 10 15.95 102 4.89 15 20.96 101 4.58 GLU 1.03 0.5 1.54 102 3.80 1.0 2.05 102 4.96 3.0 4.14 104 4.61 UA 61.34×10-3 50×10-3 112.07×10-3 101 4.61 100×10-3 165.66×10-3 104 4.38 200×10-3 267.43×10-3 103 3.14

表2 干式生化分析法加标回收率和标准偏差(RSD) Table 2 Recoveries and RSD of dry chemistry method for CO2-CP, GLU and UA

2.4.2 稳定性 以日立7180全自动生化分析仪测定血清为样本, 分别在第1、15、30 d用干化学法测定1次, 评价所制备的干片在一个月内是否稳定。测得CO₂-CP、GLU、UA浓度的平均值分别为25.37、4.78和0.325 mmol/L, 标准差为1.2178、0.1802、0.0130, 变异系数为4.8%、3.7%、4.0%, 均小于5%, 证明本方法在一个月内稳定性良好。

2.4.3 批内、批间重复性 用建立的干化学法对高、低值标准血清重复测定20次, 计算浓度均值、标准差、变异系数, 见表3, 该方法测定CO₂-CP、GLU、UA高值、低值的批间、批内变异系数均小于5%, 在允许范围内。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 批内、批间重复性实验结果 Table 3 Reproducibility test of intra and inter assay Serum sample Intra/inter average concentration/(mmol·L-1) Intra/inter SD( n=20) Intra/inter CV/% CO2-CP high-values 43.71/29.86 1.9397/1.0749 4.1/3.6 CO2-CP low-values 32.47/22.83 1.2046/0.8847 3.71/3.7 GLU high-values 8.35/6.09 0.264/0.2801 3.2/4.6 GLU low-values 7.31/4.58 0.2193/0.1694 3/3.7 UA high-values 0.514/0.436 0.018/0.0281 3.5/5 UA low-values 0.364/0.237 0.0094/0.00924 2.6/3.9

表3 批内、批间重复性实验结果 Table 3 Reproducibility test of intra and inter assay

2.4.3 方法学比较 分别对干化学法与全自动生化分析仪检测数据比较, 每个样品测定5次, 取其均值。将测定的各项目的反射光相对强度值代入相应的标准曲线中, 得到浓度值, 再计算其平均值, 即得到干化学法的浓度平均值。 全自动生化分析仪测定CO₂-CP、GLU、UA三项指标选择的波长分别为546、510、505 nm, 反应温度均为37 ℃, 样品加样量分别为5、3、8 μL。 对比数据见图3。

图3

Fig.3

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	图3 临床检验与干化学法测定CO2-CP( A)、GLU( B)、UA( C)的比较结果图Fig.3 Comparison results between clinical examination and dry chemistry for analysis of CO2-CP( A), GLU( B) and UA( C)

综上, 由于干化学检测方法为半定量检测方法, 精密程度无法与医院大型仪器相比, 由图可知, 干化学法与医院临床日立7180全自动生化分析仪的检测结果趋势大体一致, 相关系数均大于0.99, 因此可以达到前期的应用目的。