聚乙烯醇1750±50(PVA,≥99.0%,国药集团化学试剂有限公司);肝素钠(阿拉丁试剂(上海)有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,上海华康科技开发公司);甲苯胺蓝(Toluidine blue,TB,国药集团化学试剂有限公司);二甲亚砜(DMSO,≥99.0%,国药集团化学试剂有限公司);正己烷(≥95.0%,西陇化工股份有限公司);二甲亚砜和正己烷均为分析纯试剂;NIH/3T3细胞(深圳大学医学院培养);去离子水(自制)。

78HW-1型数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司);JC2000C1型接触角测定仪(上海中晨数字技术设备有限公司);CMT4304型电子拉力机(美国美斯特有限公司);UV-2501PC型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);CB-150型CO₂恒温培养箱(德国Binder公司);XDS-1B型倒置显微镜(上海长方光学仪器有限公司)。

1.2.1 复合水凝胶的制备 按一定比例称取适量的肝素钠和PVA,以及一定体积的水和DMSO混合,90 ℃至熔融态,将熔融态物质倒入高度为0.5 mm的模具中,在-20 ℃的温度下冷冻,每冷冻11 h后解冻1 h,如此反复冷冻-解冻6次,最终得到肝素钠/聚乙烯醇复合水凝胶材料。 将复合水凝胶材料保存在温度为-20 ℃的冰箱中,以备使用。

1.2.2 透光率测试 剪取适当大小溶胀平衡的水凝胶,竖直放置于比色皿中,并装满生理盐水,用紫外分光光度计测定样品在波长范围为300~800 nm间的透光率。

1.2.3 含水率的测定 取适量溶胀平衡的复合水凝胶材料,用滤纸吸干材料表面水分后称重,得溶胀平衡水凝胶试样的重量 m₁,将水凝胶试样在真空干燥箱中完全干燥后称重,得完全干燥试样的重量 m₂。 含水率 w_e的计算如式(1)^[11,12]:

we=m1-m2m1×100%(1)

1.2.4 材料表面亲水性测试 用滤纸吸干材料表面的水分,将生理盐水滴在试样材料的表面,用接触角测定仪测定水滴与材料表面的接触角大小。

1.2.5 力学性能测试 将材料按GB/T 1040-1992裁剪成10 mm×40 mm×0.5 mm的试样,有效测试长度为20 mm,用万能电子拉力机测试试样的拉伸强度及断裂伸长率, 拉伸速度为30 mm/min,测试温度为25 ℃。

1.2.6 肝素钠释放量的测定 以PBS(pH=7.4)配制40 mg/L的标准肝素钠溶液,分别量取肝素钠标准液0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL加入试管中,并加PBS溶液至3 mL,加2 mL质量分数为0.005%的TB溶液(PBS作溶剂),充分摇荡1 min,使肝素钠与TB反应形成配合物,加入5 mL正己烷,摇荡1 min,使配合物被萃取到有机层,未络合的TB仍留在水相中,取水相于630 nm处测定吸光度 A值。 以肝素钠体积分数为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线^[13]。

剪取面积大小为1 cm×1 cm的复合水凝胶作为测试样品,烘干称重后将样品浸泡在5 mL的PBS中7 d,取出样品,以TB吸光光度法测量浸泡液的肝素钠体积分数。 肝素钠释放质量占整个样品质量的百分比用 P表示,计算公式如式(2):

P=m3m4×100%(2)

式中, P表示肝素钠质量占整个样品质量的百分比, m₃为水凝胶样品在浸泡液中的肝素钠质量, m₄为水凝胶样品烘干后质量。

1.2.7 细胞粘附实验 将消毒后无菌的样品材料平铺于24孔培养板的底部,NIH/3T3细胞重选之后接种到材料上,将培养板放入CO₂恒温培养箱中进行培养,8 h后将样品材料转移到新的24孔板,加PBS覆盖材料,在倒置显微镜下观察细胞粘附情况。

图1中列出了纯PVA水凝胶以及肝素钠/聚乙烯醇复合水凝胶的透光率,在可见光区400~750 nm波长范围内,随着肝素钠添加量的逐渐增加,复合材料的透光率逐渐的降低。 这是因为肝素分子不会与PVA分子链形成交联结构,肝素钠在复合水凝胶中以游离的状态存在,会对光线产生散射、折射及反射,这将会阻碍光线的透过。图2为复合水凝胶透明度效果图,1~6号样品分别是肝素钠质量分数为0~5%的水凝胶材料,从图中可以看出随着肝素钠添加量的增加,样品的透明度逐渐下降。 所以,肝素添加量的增加会降低光的透过率,但少量的添加对材料的透光率影响并不是很大,当肝素钠为5%时,复合材料的透光率最低值为92%,符合国家标准(GB 11417.2-1989)。

图1

Fig.1

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	图1 复合水凝胶材料的透光率曲线Fig.1 Transmittance of the composite hydrogel

图2

Fig.2

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	图2 6片复合水凝胶在印字纸张上光学照片Fig.2 Optical image of six plates of composite hydrogel on a printed paper

表1为复合水凝胶的含水率。 从表1可知,复合水凝胶的含水率随着肝素钠添加量的增加而增高,但是含水率的增加量较小。 当肝素钠为0时,即为纯PVA水凝胶时,含水率为72.6%;肝素分子中含有大量的—COOH、—OH等亲水性基团,当复合材料中肝素钠添加量逐渐增加时,肝素分子中大量的—COOH、—OH等亲水基团可以更多地结合水分子,使含水率上升;当含水率在72%~78%的范围内,可以保持眼内的润湿度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 复合水凝胶材料的含水率 Table 1 Moisture content of the composite hydrogel w(HS)/% 0 1 2 3 4 5 we/% 72.6 74.9 76.4 77.7 77.9 78.0

表1 复合水凝胶材料的含水率 Table 1 Moisture content of the composite hydrogel

图3

Fig.3

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	图3 肝素钠质量分数对水滴在复合水凝胶材料表面的接触角影响Fig.3 The effect of heparin sodium mass fraction on the contact angle of composite hydrogel

肝素钠作为亲水性分子可以提高复合凝胶的亲水性能,因此有必要研究不同质量分数肝素钠对复合水凝胶的亲水性能的影响。 实验结果如图3所示:肝素钠为0,PVA水凝胶的接触角为41.1°;当加入肝素钠后,接触角开始变小,肝素钠从1%变化到5%时,接触角从35.4°降低到22°。 造成上述结果的原因是肝素钠结构中—COOH、—OH等亲水性基团提高了复合凝胶的亲水性能。

图4

Fig.4

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	图4 肝素钠质量分数对复合水凝胶材料拉伸强度和断裂伸长率的影响Fig.4 Effects of heparin sodium on the enlongation at break and tensile strength of composite hydrogel

由图4可以看出,随着肝素钠增加,复合材料的拉伸强度和断裂伸长率均逐渐下降。 因为肝素钠分散在水凝胶材料中时,会对PVA分子链之间的网络结合和羟基之间的氢键结合产生阻碍作用,降低PVA水凝胶三维网络的交联程度,而且这种阻碍作用会随着肝素钠添加量的增加而增大,所以肝素钠的添加会使得复合材料的力学性能下降。 但是肝素钠在1%~5%的拉伸强度在0.55~0.76 MPa之间,远高于人的正常眼压(约为1.95 kPa)。 同时,断裂伸长率也在200%以上,表明具有高弹性,以满足植入手术过程中的拉伸缝合。

根据实验方法制作了TB吸光光度法测定肝素钠质量浓度的标准曲线,如图5所示。 在肝素钠质量浓度为0~10 mg/L范围内,肝素钠质量浓度 ρ与吸光度 A值之间的线性回归方程为 A=2.1561-0.1713 ρ(mg/L),线性相关系数 r=0.995,线性关系良好。

图5

Fig.5

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	图5 肝素钠吸光度质量分数的标准曲线Fig.5 Standard curve of absorbance and mass concentration for heparin sodium

图6

Fig.6

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	图6 复合水凝胶吸收光谱Fig.6 Absorption spectra of composite hydrogel

TB吸光光度法测定浸泡液的吸光度如图6所示,根据标准曲线图5及线性回归方程 A=2.1561-0.1713 ρ(mg/L),经计算可得到各浸泡液中肝素钠的质量浓度 ρ,进而得到水凝胶样品所释放出来的肝素钠质量 m₃及肝素钠释放量百分比 P,见表2。 从表2可以看出,随着复合水凝胶中肝素钠的增加,肝素钠的释放质量以及肝素钠释放质量所占的百分比均会逐渐增加,当肝素钠从2%增加到3%时,肝素钠释放质量百分比由0.082%增加到0.20%,肝素钠继续增加时,肝素钠释放量百分比增加不明显。 由此可见,肝素钠添加量为3%的复合水凝胶的肝素钠释放性最佳。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 肝素钠释放质量及释放质量百分比 Table 2 Release amount and release rate of heparin sodium w(HS)/% A m3/μg m4/μg P/% 1 2.117 1.141 8900 0.012 2 1.885 7.913 9600 0.082 3 1.468 20.085 9800 0.20 4 1.368 23.003 9700 0.24 5 1.325 24.258 9100 0.27

表2 肝素钠释放质量及释放质量百分比 Table 2 Release amount and release rate of heparin sodium

图7为在倒置显微镜下观察到的细胞粘附图,图中伸展(呈梭形)的细胞表示粘附于材料表面,圆形细胞表示吸附于材料表面,但并未粘附。 其中图7 A为对照组PVA水凝胶表面的细胞粘附图,可以看到有较多细胞粘附于材料表面。图7 B为肝素钠3%的HS/PVA复合水凝胶表面的细胞粘附图,少量的细胞吸附在材料表面,极少的细胞粘附于材料表面。 由图7 B与7 A对比可知,HS/PVA复合水凝胶材料的抗细胞粘附能力相较于纯PVA水凝胶获得明显改善,可能的原因是:一方面肝素分子释放到材料表面,显著地提升了材料的亲水性(接触角降低),表面形成的水化膜可以一定程度上阻止细胞的粘附;另一方面是肝素分子链带高负电荷,与细胞之间形成的负负静电斥力阻止细胞的粘附。

图7

Fig.7

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	图7 纯PVA水凝胶( A)和肝素钠3%的HS/PVA复合水凝胶( B)光学显微镜照片Fig.7 The optical microscope images of PVA hydrogel( A) and HS/PVA composite hydrogel(HS content is 3%, B)